頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定阿維巴坦鈉中三甲胺、三乙胺

孫玉雙，賈全，表亞囡，鞏海雪，鮑楠楠

（華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 052165）

β-內(nèi)酰胺類抗生素作為一種廣譜抗菌藥物，適應(yīng)癥廣、臨床療效好，因此應(yīng)用廣泛，但是細(xì)菌對(duì)這類藥物所產(chǎn)生的耐藥性逐步增強(qiáng)，已嚴(yán)重降低其治療效果，研制β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，作為增效劑與之聯(lián)用，可有效地恢復(fù)耐藥菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[1]；作為第一個(gè)用于臨床的二氮雜雙環(huán)辛烷類化合物，阿維巴坦可以長(zhǎng)效抑酶[2]；同時(shí)，阿維巴坦也是一種新型的酶抑制劑，勢(shì)必會(huì)得到廣泛應(yīng)用[3]；阿維巴坦原料藥制備過(guò)程中，用到了三甲胺、三乙胺這兩種有機(jī)溶劑，殘留溶劑作為藥物中的一類重要雜質(zhì)，其殘留水平高于安全閾值時(shí)，會(huì)對(duì)人體或環(huán)境產(chǎn)生危害[4]。因此，藥物殘留溶劑的檢測(cè)及有效控制極其重要，本文建立了毛細(xì)管氣相色譜頂空進(jìn)樣法測(cè)定阿維巴坦鈉中三甲胺、三乙胺的殘留，操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，可用于阿維巴坦鈉原料藥中三甲胺、三乙胺殘留的測(cè)定。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A 氣相色譜儀及工作站（FID 檢測(cè)器），Agilent 7697A 頂空進(jìn)樣器。28%三甲胺溶液、三乙胺、二甲基亞砜、氫氧化鈉均為分析純，水為純化水，載氣為高純氮?dú)狻?/p>

2 測(cè)定方法

2.1 色譜條件

以CP-Volamine 為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱（Agilent CP-Vlamine，30 m×0.32 mm，0.5 μm）；起始溫度為40 ℃保持5 min，然后以15 ℃/min 的升溫速率升溫至180 ℃保持2 min，后運(yùn)行程序：230 ℃維持5 min。進(jìn)樣口溫度為200 ℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度為250 ℃，頂空平衡爐溫90 ℃、進(jìn)樣針120 ℃、傳輸線140 ℃，平衡時(shí)間為30 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液

精密量取0.1 mol/L NaOH 溶液0.2 mL，二甲基亞砜1.8～20 mL 頂空瓶中，搖勻密封，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液

精密稱取28%三甲胺溶液、三乙胺各適量，用二甲基亞砜定量稀釋制成每1 mL 中約含三甲胺10.5 μg、三乙胺32.0 μg 的溶液，作為對(duì)照品貯備液；精密量取1～10 mL 量瓶，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入二甲基亞砜溶解并定容，搖勻，精密量取2～20 mL 頂空瓶中，密封，備用。

2.2.3 供試品溶液

精密稱取樣品0.1 g，于10 mL 量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入二甲基亞砜溶解并定容，搖勻，精密量取2～20 mL 頂空瓶中，密封，即得。

2.2.4 溶劑定位溶液

精密稱取28%三甲胺適量，用二甲基亞砜溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含10.5 μg 的溶液，作為三甲胺貯備液；精密稱取三乙胺適量，用二甲基亞砜溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含32.0 μg 的溶液，作為三乙胺貯備液；分別精密量取1～10 mL 量瓶，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入二甲基亞砜溶解并稀釋定容，搖勻，精密量取2 mL 至20 mL 頂空瓶中，密封后備用。

2.2.5 供試品加標(biāo)溶液

精密稱取樣品0.1 g 于10 mL 量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入對(duì)照品貯備液（按“2.2.2”項(xiàng)下配制）1 mL，用二甲基亞砜溶解并定容，搖勻，精密量取2～20 mL 頂空瓶中，密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，三甲胺、三乙胺、二甲基亞砜之間的分離度均大于1.5，三甲胺、三乙胺峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.6%、1.9%，均小于10.0%，符合要求。

2.4 專屬性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取空白溶液、對(duì)照品溶液、三甲胺定位溶液、三乙胺定位溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1，空白溶液在三甲胺、三乙胺保留時(shí)間處均無(wú)色譜峰，對(duì)目標(biāo)溶劑的測(cè)定無(wú)干擾，該方法專屬性良好。

2.5 檢測(cè)限和定量限

取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，信噪比約為3 時(shí)作為檢測(cè)限溶液，并計(jì)算檢測(cè)限；信噪比約為10 時(shí)作為定量限溶液，并計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 線性和范圍

精密稱取28%三甲胺、三乙胺各適量于不同的量瓶，分別用二甲基亞砜溶解并定量稀釋制成濃度約為2.1 μg/mL 的三甲胺貯備液，濃度約為6.4 μg/ mL的三乙胺貯備液；精密量取三甲胺貯備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、7.5 mL 于10 mL量瓶，精密量取三乙胺貯備液0.4 mL、1.0 mL、2.5 mL、4.0 mL、5.0 mL、7.5 mL 于10 mL 量瓶，各加入0.1 mol/ L NaOH 溶液1 mL，用二甲基亞砜溶解并定容，搖勻，作為線性溶液。

取上述溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果表明，三甲胺在0.209 4～1.570 4 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，回歸方程為：y=21.1495x-0.243 1（R=0.999 6）；三乙胺在0.265 4～4.977 0 μg/ mL 濃度范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，回歸方程為：y=14.931 8x+ 0.170 7（R=0.999 9），線性關(guān)系良好。

圖2 三甲胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of trimethylamine

圖3 三乙胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of triethylamine

2.7 精密度試驗(yàn)

分別平行配制6 份供試品加標(biāo)溶液（按“2.2.5”項(xiàng)下配制），照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，三甲胺峰面積的RSD 為1.3%（n=6）；三乙胺峰面積的RSD為1.8%（n=6），方法精密度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液、供試品加標(biāo)液分別在室溫放置12 h，頂空進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)照品溶液色譜圖中，三甲胺峰面積的RSD 為1.8%，三乙胺峰面積的RSD 為2.5%；供試品加標(biāo)液色譜圖中，三甲胺峰面積的RSD 為2.2%，三乙胺峰面積的RSD為2.1%，說(shuō)明對(duì)照品溶液、供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下配制3 份對(duì)照品貯備液；精密稱取樣品1.0 g 至10 mL 量瓶（9 份），分別加入對(duì)照品貯備液0.2 mL、1.0 mL、1.5 mL（每個(gè)濃度各3份），加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，用二甲基亞砜溶解并稀釋定容，搖勻，精密量取2～20 mL 頂空瓶中，密封，作為回收率低、中、高溶液；另按照“2.2.3”項(xiàng)下配制3 份供試液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別取上述溶液進(jìn)樣測(cè)定，三甲胺平均回收率為96.0%，RSD=1.0%（n=9）；三乙胺平均回收率為96.3%，RSD=1.3%（n=9），準(zhǔn)確度符合要求。

2.10 樣品的測(cè)定

取本品3 批，按“2.1“項(xiàng)下的色譜條件分別測(cè)定，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算三甲胺、三乙胺的殘留量；結(jié)果表明，3 批次樣品中均未檢出三甲胺、三乙胺。采用本方法，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定阿維巴坦鈉原料藥中的三甲胺、三乙胺。

3 討論

3.1 耐用性

結(jié)合目標(biāo)溶劑的性質(zhì)及色譜柱特性，對(duì)比了DB-624 以及Agilent CP-Volamine 色譜柱，結(jié)果表明，DB-624 色譜柱檢測(cè)目標(biāo)溶劑峰形差，拖尾嚴(yán)重；Agilent CP-Volamine 柱檢測(cè)峰形好，靈敏度高，且檢測(cè)無(wú)干擾，故選擇該毛細(xì)管柱作為分析色譜柱。通過(guò)改變初始柱溫±5 ℃、流速±0.2 mL/min、進(jìn)樣口溫度±5 ℃、檢測(cè)器溫度±5 ℃來(lái)考察方法的耐用性，結(jié)果表明，在上述各色譜條件微小波動(dòng)下，各峰分離度符合要求，系統(tǒng)適用性符合要求，方法耐用性良好。

3.2 色譜條件的選擇

本文論述的分析方法中，平衡溫度的選擇結(jié)合了樣品中目標(biāo)溶媒的沸點(diǎn)以及樣品的熱穩(wěn)定性，并盡量避免了樣品中揮發(fā)性熱分析物對(duì)測(cè)定的干擾[5]?？紤]到三乙胺的沸點(diǎn)較高為89.5 ℃，溶劑二甲基亞砜的沸點(diǎn)為189 ℃，本文檢測(cè)方法選擇90 ℃作為頂空平衡溫度。

3.3 限度的制定

三甲胺殘留限度的制定依據(jù)GB 2730—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)腌臘肉制品》[6]中，三甲胺氮的限度為≤2.5 mg/100g，另，依據(jù)GB5009.179—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中三甲胺的測(cè)定》[7]折算出三甲胺的限度為≤10.5 mg/100 g，即105 ppm；三乙胺殘留限度的制定依據(jù)ICH Q3C（R7）《雜質(zhì)：殘留溶劑的指導(dǎo)原則》[8]及《中國(guó)藥典》2020年版四部通則《0861 殘留溶劑測(cè)定法》[9]中，將三乙胺列為第三類溶劑，限度0.5%；結(jié)合EDQM，本文從嚴(yán)制定限度為3.2×10-4；從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，三批樣品中的三甲胺、三乙胺的殘留量均符合限度要求。

4 結(jié)束語(yǔ)

目前，關(guān)于阿維巴坦鈉原料藥中三甲胺、三乙胺殘留量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少，本文建立的檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于阿維巴坦鈉原料藥中三甲胺、三乙胺含量的測(cè)定，同時(shí)，對(duì)其殘留溶劑及相關(guān)質(zhì)量研究具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。