雛雞雞白痢病原菌的分離鑒定及耐藥性檢測(cè)

楊 兵，喻 芳，李金兆，鄧元彬

（1.內(nèi)江市東興區(qū)石子鎮(zhèn)人民政府，四川內(nèi)江641107；2.內(nèi)江市東興區(qū)平坦鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，四川內(nèi)江641107；3.內(nèi)江市東興區(qū)白合鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，四川內(nèi)江641107；4.內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川內(nèi)江641000）

雛雞白痢病是一種由雞白痢沙門氏菌引起的一種常呈流行性爆發(fā)的禽類傳染性疾病，對(duì)雞和火雞的危害極大，其中對(duì)2～3周齡雛雞具有很大危害，以雛雞急性敗血癥和表現(xiàn)出白痢為主。本試驗(yàn)在對(duì)內(nèi)江3個(gè)雞場(chǎng)雞白痢沙門氏菌分離鑒定的基礎(chǔ)上，用10種常用抗菌藥物對(duì)分離株進(jìn)行了耐藥性監(jiān)測(cè)和分析，為臨床上合理選擇用藥、有效防治雞白痢沙門氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源

1.1.1 病例1

龔家鎮(zhèn)某雞場(chǎng)于2020年4月購入雛雞2000余只，雛雞飼養(yǎng)6 d后，有2只雛雞出現(xiàn)死亡；7 d時(shí)，部分雛雞出現(xiàn)精神不振、食欲減退、扎堆等情況，4只雛雞出現(xiàn)死亡；8 d時(shí)，以上現(xiàn)象更加明顯，死亡雛雞數(shù)量增至20余只。期初，養(yǎng)殖戶認(rèn)為是由于育雛溫度控制不當(dāng)所致，于是相應(yīng)增加了育雛房的室溫，并添加恩諾沙星、電解多維于2種禽藥于雛雞飲水之中，但是相關(guān)癥狀并未得到緩解，9 d時(shí)雛雞死亡數(shù)量已達(dá)40余只，10d時(shí)死亡雛雞數(shù)量超過100只，遂就診。經(jīng)對(duì)死亡雛雞解剖發(fā)現(xiàn)，病死雛雞肝臟和脾臟腫大，有點(diǎn)狀出血或灰白色還試點(diǎn)，膽囊較充盈。對(duì)采集的樣品做藥敏試驗(yàn)，采用高敏藥甲砜霉素每2 d對(duì)雛雞進(jìn)行肌肉注射，并用二氟沙星兌水喂食雛雞，用藥后雛雞死亡率明顯降低，5d后所有雛雞全部恢復(fù)正常。

1.1.2 病例2

全安鎮(zhèn)某雞場(chǎng)2020年4月購買雛雞1400余只，雛雞飼養(yǎng)第4d，有4只雛雞突然死亡，其余雛雞無明顯癥狀，僅有極少部分雛雞出現(xiàn)了精神不振、食欲減退、扎堆、肛門周邊黏附白色糞便等癥狀，于是就診。經(jīng)過剖檢發(fā)現(xiàn)與病例1極為相識(shí)，于是采用病例1的救治方式進(jìn)行治療，2 d后病狀得到緩解，6 d后所有雛雞恢復(fù)正常。

1.1.3 病例3

銀山鎮(zhèn)某雞場(chǎng)2020年5月購買雛雞1300余只，飼養(yǎng)5d后突然有雛雞出現(xiàn)死亡，極少部分雛雞出現(xiàn)與病例1、病例2相似的癥狀，遂就診。經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)與案例1、2極其相似，同時(shí)采用病例1和病例2的救治方式進(jìn)行質(zhì)量，用藥2 d后雛雞停止死亡，持續(xù)用藥6 d后，全部雛雞恢復(fù)正常。

無菌采集上述3雞場(chǎng)的發(fā)病雛雞的肝、脾組織，回到實(shí)驗(yàn)室對(duì)所采取的病料做細(xì)菌分離鑒定。

1.2 培養(yǎng)基

SS沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基（13 g、加蒸餾水200mL）、普通瓊脂培養(yǎng)基（用NaCl 1g、牛肉膏2 g、蛋白胨1 g、瓊脂粉1.5 g，加蒸餾水100mL）。分別置于電爐上加熱溶解后補(bǔ)足失水、調(diào)節(jié)pH值為7.3±0.2，將SS沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基倒在平皿上，每個(gè)平皿15mL制成平板；普通瓊脂培養(yǎng)基分別倒在平皿（15mL/個(gè)）和試管（3mL/支）制成平板和斜面，將平板和斜面置于115℃高壓蒸氣滅菌20 min進(jìn)行高壓滅菌[2]。

1.3 革蘭氏染色液

第1液：將2.5 g結(jié)晶紫融于濃度為95%的酒精（25.0mL）之中，配置成A液；將濃度1%的草酸銨溶液融于蒸餾水之中，配置成B液，將A液與B液混合即可獲得第1液[3]。

式中：S與γ分別為每天需要攤鋪的面積與每平米灑透層油量[3]。在充分結(jié)合工程實(shí)際后，令γ取值為0.3L/m3，因此通過上述公式計(jì)算可知Qo的值大約為3800L，因而在本工程項(xiàng)目中最終決定使用兩臺(tái)西安達(dá)剛生產(chǎn)的DGL5250以及GLS型號(hào)的智能瀝青灑布車，以有效完成這一施工任務(wù)。

第2液：將2 g碘化鉀溶300mL的蒸餾水，獲得溶液后將1 g碘放入獲得的溶液中，并進(jìn)行稍微的加熱溶解，最后對(duì)蒸發(fā)的蒸餾水進(jìn)行補(bǔ)足[3]。

第3液：脫色劑可選用濃度為95%的酒精或用70mL濃度為95%的酒精與30mL丙酮制成的混合溶液。

第4液：用濃度為2.5%的番紅與10mL濃度為95%的酒精，加90mL蒸餾水配置成花紅染色液。

1.4 生化發(fā)酵管

本試驗(yàn)主要會(huì)用到葡萄糖生化試驗(yàn)管、乳糖生化試驗(yàn)管、麥芽糖生化試驗(yàn)管、甘露醇生化試驗(yàn)管、蔗糖生化試驗(yàn)管、木糖生化試驗(yàn)管、肌醇生化試驗(yàn)管。

1.5 藥敏紙片

主要有甲砜霉素藥敏紙片、頭孢噻呋藥敏紙片、卡那霉素藥敏紙片、慶大霉素藥敏紙片、新霉素藥敏紙片、恩諾沙星藥敏紙片、環(huán)丙沙星藥敏紙片、氟哌酸藥敏紙片、鏈霉素藥敏紙片和阿米卡星藥敏紙片。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物

5日齡健康小雞50只，在內(nèi)江市龔家鎮(zhèn)市場(chǎng)上購買?；氐綄?shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)觀察3d，選用精神良好、采食和飲水都正常的健康小雞30只用作動(dòng)物回歸試驗(yàn)。

1.7 試驗(yàn)儀器

主要有恒溫箱、高壓滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、電爐、天秤、接種環(huán)、燒杯、酒精燈。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

2.2 染色與形態(tài)觀察

2.3 細(xì)菌的純培養(yǎng)

用接種環(huán)挑取適量鑒定后的病原菌劃線接種在普通的瓊脂平板和斜面上，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

2.4 生化試驗(yàn)

用接種環(huán)挑取3株病原菌純培養(yǎng)物，分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖和肌醇生化反應(yīng)管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察糖發(fā)酵管內(nèi)的產(chǎn)氣和顏色情況[4]。

2.5 耐藥性試驗(yàn)

向純培養(yǎng)后的帶菌斜面注入適量的滅菌蒸餾水，將斜面上的菌落洗下，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×108CFU/mL或1.5×108CFU/mL，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝?，取適量的菌落洗液均勻涂抹在事先準(zhǔn)備好的瓊脂平板表面，蓋上平板于室溫中放置數(shù)分鐘，用無菌小鑷子將各種藥敏試紙貼于瓊脂平板表面，試紙間間隔不少于24 mm，試紙與平板邊緣的預(yù)留距離不能少于15mm。本次試驗(yàn)采用的瓊脂平板直徑為90mm，放置藥敏試紙數(shù)量為4張，在37℃的恒溫室中培養(yǎng)了18 h。培養(yǎng)完成后，取出瓊脂平板，對(duì)藥敏試紙周邊是否形成抑菌圈進(jìn)行了細(xì)致觀察，對(duì)于形成了抑菌圈的藥敏試紙要測(cè)量和收集抑菌圈的直徑大小，并按此標(biāo)準(zhǔn)作為指示供試菌株敏感、中度敏感和耐藥的依據(jù)。其判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈20mm以上為高敏藥物，10～20mm為中敏藥物，10mm以下為低敏藥物[5]。

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將30只小雞隨機(jī)為3個(gè)小組，每組10只。取含有菌落的洗液將其滴服給各小組的小雞：病例1的滴服給第1組的小雞，病例2的滴服給第2組的小雞，病例3的滴服給第3組的小雞，0.5mL/只。不采用任何的抗菌藥物對(duì)3組小雞做給藥的處理。觀察雞只的發(fā)病情況、死亡情況及病理變化。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

此次試驗(yàn)，共發(fā)現(xiàn)3株沙門氏菌的疑似病例，所有疑似病例直徑約為2～3 mm，呈現(xiàn)出圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落。

3.2 染色與形態(tài)觀察

革蘭氏染色鏡檢，3株細(xì)菌均為革蘭氏陰性。視野中可見有大量散在排列、單個(gè)存在、兩端稍圓、形態(tài)均一、中等大小的細(xì)長桿菌。

3.3 細(xì)菌的純培養(yǎng)

瓊脂平板和斜面上均長出大量的細(xì)菌其菌落為圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落，直徑約2～3 mm不等，平板較斜面更為明顯。

3.4 生化試驗(yàn)

試驗(yàn)表明分離出的3株疑似沙門氏菌均符合雞白痢沙門氏菌菌的特性，具體詳情見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Thebiochemical test results

3.5 耐藥性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，3株細(xì)菌均對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟哌酸、鏈霉素等4種藥物低敏或不敏，對(duì)其余4種藥物中敏或高敏，其中3株病菌均對(duì)頭孢噻呋高敏[6]，具體情況見表2。

表2 10種藥物的抑菌圈直徑Tab.2 The diameter of inhibition zoneof 10drugs

3.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將分離出的3株沙門氏菌培養(yǎng)物菌落洗液給小雞滴服后，于第2 d出現(xiàn)精神萎靡、采食下降、拉灰白稀糞等癥狀，第3 d出現(xiàn)四線，3組試驗(yàn)小雞分別死亡4只、3只和6只。對(duì)死亡小雞進(jìn)行解剖后所見癥狀與前面3個(gè)案例癥狀表現(xiàn)一致，對(duì)病變器官進(jìn)行細(xì)菌分離后得到與種菌相同的細(xì)菌。

4 討論

4.1 耐藥性的產(chǎn)生

本次試驗(yàn)可以明顯的觀察到恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟哌酸、鏈霉素產(chǎn)生的很強(qiáng)的耐藥性，這些藥物都是長期以來常用的治療沙門氏菌的藥物。這4種藥物都對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑制和殺滅效果。前3種為喹諾酮類藥物，對(duì)沙門氏菌及腸道細(xì)菌引發(fā)的疾病有很好的治療效果，也正是因?yàn)樯鲜?類中的4種藥物對(duì)沙門氏菌的治療效果明顯，導(dǎo)致廣大的養(yǎng)殖戶在發(fā)病的過程中大量的投用，從而使沙門氏菌對(duì)其產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性。

4.2 現(xiàn)有藥物的合理使用

近幾年，針對(duì)雞白痢，主要使用恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟哌酸、鏈霉素等西藥，以上藥物雖然在藥敏試驗(yàn)中起到了一定的抑菌作用，但是實(shí)踐效果并不理想，甚至?xí)o效；慶大霉素、卡那霉素等西藥藥敏試驗(yàn)表現(xiàn)較好，但許多雞場(chǎng)按照推薦用量用藥取得的效果仍不顯著。究其原因是因?yàn)殡u的消化道對(duì)慶大霉素或卡那霉素的吸收消化較少，而雞白痢屬于急性敗血性感染，單純依靠慶大霉素或卡那霉素效果并不顯著，而且還會(huì)造成防治失敗和藥物浪費(fèi)[7]。為此，在雞白痢病防治中，可以使用中藥或者是中西藥共同來防治。

4.3 雛雞白痢發(fā)病的因素

雛雞的生活環(huán)境也會(huì)直接影響到雛雞是否會(huì)得白痢病，因此，日常養(yǎng)雞要高度重視養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生，確保雞舍干凈、通風(fēng)。對(duì)于雞舍中的各項(xiàng)設(shè)施要堅(jiān)持做到常消毒，進(jìn)而降低雛雞發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。雞白痢沙門氏菌病還是典型的垂直傳播，因此在雞場(chǎng)新引進(jìn)小雞的時(shí)候最好對(duì)種雞場(chǎng)的雞白痢的發(fā)病情況做了解，這樣可以減少雞場(chǎng)的損失。

5 結(jié)論

通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，3個(gè)疑似病例均為雛雞沙門氏菌感染。本次試驗(yàn)共采用了10種常用的抗菌藥物，用于試驗(yàn)3株病原菌均對(duì)3種以上的藥物產(chǎn)生了耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生主要是由于長期使用同一種常用藥物所引起的。本次耐藥試驗(yàn)可以明顯的觀察到恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟哌酸、鏈霉素產(chǎn)生耐藥性最為強(qiáng)烈。因此在以后的養(yǎng)殖預(yù)防和治療用藥的中應(yīng)注重不同藥物的混合使用，盡量減少長期使用的常用的治療沙門氏菌的藥物的應(yīng)用。