枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備花生餅粕、花生莖葉混合飼料條件優(yōu)化研究

遲吉捷石太淵

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110161)

花生是我國(guó)主要的油料作物,國(guó)家統(tǒng)計(jì)局信息顯示2019 年我國(guó)花生年產(chǎn)量約1 750 萬(wàn)t,居世界首位,花生在油料產(chǎn)業(yè)具有重要的地位?；ㄉ缓椭⒌鞍住⒕S生素及多種礦物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)全面,具有保護(hù)心腦血管、降脂、降糖、抗癌、抗衰老等保健作用。近幾年,我國(guó)花生用于食品加工的比例在逐年提升,已接近年產(chǎn)量的50% 。目前,我國(guó)花生仍以榨油為主,花生種植、加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的花生粕、花生紅衣、花生殼、根莖等副產(chǎn)物,其中花生餅粕850 萬(wàn)t/年、花生莖葉1 800 萬(wàn)t/年以上,這些副產(chǎn)物中富含酚類、蛋白質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)成分,但目前利用率卻較低。對(duì)這些副產(chǎn)物進(jìn)行綜合利用及精深加工,不僅可以延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈,提高花生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,還可以減少資源浪費(fèi),避免因副產(chǎn)物廢棄而造成環(huán)境污染[1～3]。

花生餅粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高其代謝能量是所有餅粕類飼料中最高的,粗蛋白質(zhì)含量接近大豆粕,高達(dá)45%以上,粗纖維7%左右。精氨酸含量高達(dá)5.2%,是所有動(dòng)、植物飼料中最高的。賴氨酸含量只有大豆餅粕的50%左右,蛋氨酸、賴氨酸、蘇氨酸含量都較低。通過添加合成氨基酸或是添加其他的蛋白質(zhì)飼料而使氨基酸得到平衡,畜禽的生長(zhǎng)性能也可達(dá)到理想水平[4～6]。

花生莖葉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,花生莖葉中含有12.9%粗蛋白質(zhì)、2%粗脂肪、46.8%碳水化合物,其中花生葉的粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)20%。

花生秧中的粗蛋白質(zhì)含量是豌豆秧的1.6 倍、稻草的6 倍,畜禽采食1 kg 花生秧產(chǎn)生的能量相當(dāng)于0.6 kg大麥所產(chǎn)生的能量。

花生餅粕以及花生莖葉很容易感染黃曲霉菌而產(chǎn)生黃曲霉毒素。黃曲霉毒素種類較多,其中毒性最大的是黃曲霉毒素B1。蒸煮、干熱對(duì)去除黃曲霉毒素?zé)o效,因此,對(duì)花生粕中黃曲霉毒素含量應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè),國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定黃曲酶毒素的允許量需低于0.05 mg/kg。黃曲霉菌毒素易使豬的肝臟受到損害。少量的黃曲霉毒素就可對(duì)豬的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生顯著的影響。

花生餅粕和花生莖葉中的黃曲霉毒素及蛋白質(zhì)組分的不理想,在復(fù)合飼料中添加量一般在10%左右,限制了飼料中的高效利用。因此,提高花生粕和花生莖葉的質(zhì)量安全和品質(zhì),才能飼料行業(yè)中充分利用。目前,在豆粕飼料中利用枯草芽孢桿菌研究營(yíng)養(yǎng)和安全方面研究很多,但對(duì)花生粕、花生莖葉的相關(guān)研究較少[7～9]。

本研究以花生餅粕和花生莖葉為原料,采用固態(tài)發(fā)酵法,研究了枯草芽孢桿菌對(duì)花生粕和花生莖葉的發(fā)酵條件,得到最佳工藝,這對(duì)花生餅粕和花生莖葉在飼料行業(yè)中進(jìn)一步利用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料 枯草芽孢桿菌1389 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供;熱榨花生餅粕和花生莖葉市場(chǎng)購(gòu)買。

1.1.2 培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏3 g/L,NaC1 5 g/L,瓊脂 2 g/L,pH 值7.0;

枯草芽孢桿菌液體活化培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏3 g/L,NaC1 5 g/L,pH 值7.0;

枯草芽孢桿菌芽孢平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:酵母浸粉2.5 g/L 蛋白胨5 g/L,葡萄糖1.0 g/L,瓊脂1.5 g/L,pH值7.0。

固體培養(yǎng)基:用植物粉碎機(jī)粉碎花生粕和花生莖葉,顆粒大小為120 目。按每250 ml 培養(yǎng)瓶中加入25 g 固體(20 g 花生餅粕+5 g 花生莖葉)。以上培養(yǎng)基均121 ℃下滅菌20 min 備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵工藝流程 花生餅粕粉+花生莖葉粉→滅菌→冷卻→接菌→發(fā)酵→烘干→ 平板培養(yǎng)→芽孢數(shù)量→最佳發(fā)酵條件。

1.2.2 芽孢培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法 取0.5 g 發(fā)酵物干燥產(chǎn)品加入到4.5 ml 無(wú)菌水中,在80 ℃恒溫水浴中,經(jīng)10 min 滅枯草芽孢桿菌后3 000 r/min,離心10 min,上清液稀釋106 倍,取200 μl 菌液涂板培養(yǎng)15 h 后檢測(cè)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 調(diào)查以不同的料液比、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和花生莖葉量為因素對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)目的影響。

1.2.3.1 料液比對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響 取20 g 花生餅粕和5 g 花生莖葉,加2 g 菌樣,發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h,每隔12 h 攪拌1 次,分別加15、20、25、30、35 ml,料液比分別為1 ∶0.56,1 ∶0.74,1 ∶0.92,1 ∶1.11,1 ∶1.30 測(cè)定樣品的芽孢數(shù)。

1.2.3.2 接菌量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響 取20 g 花生餅粕和5 g 花生莖葉,發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h,每隔12 h 攪拌1 次,加25 ml 水,分別接種0.25 g (接菌量為0.50%)、0.50 g (接菌量為1.0%)、1.00 g(接菌量為2.0%)、1.5 g(接菌量為3.0%)、2.0 g(接菌量為4.0%)、2.5 g(接菌量5.0%)(枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為1.2×108個(gè)/g)菌量,測(cè)定樣品的芽孢數(shù)。

1.2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響 取20 g 花生餅粕和5 g 花生莖葉,加0.5 g 菌樣和25 ml 水,培養(yǎng)溫度為30 ℃,每隔12 h 攪拌1 次,分別培養(yǎng)24、36、48、60、72、84 h 枯草芽孢桿菌,測(cè)定樣品芽孢數(shù)。

1.2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響 取20 g 花生餅粕和5 g 花生莖葉,加0.5 g 菌樣和25 ml 水,培養(yǎng)時(shí)間為72 h,每隔12 h 攪拌1 次,分別在24、26、28、30、32、34 ℃下培養(yǎng),測(cè)定樣品的芽孢數(shù)。

1.2.3.5 花生莖葉含量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響取20 g 花生餅粕,加0.5 g 菌樣和25 ml 水,培養(yǎng)時(shí)間為72 h,培養(yǎng)溫度為30 ℃,每隔12 h 攪拌1 次,分別加0、2.5、5.0、7.5、10 g 的花生莖葉粉,測(cè)定樣品的芽孢數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù),采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對(duì)料液比(A)、接種量(B)、培養(yǎng)溫度(C)和培養(yǎng)時(shí)間(D)等4 個(gè)因素,設(shè)計(jì)4因素3 水平的試驗(yàn)方案[10～15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響 由圖1 中可以看出,料液比對(duì)花生餅粕中的枯草芽孢桿菌發(fā)酵有較大影響,料液比1 ∶0.92(加水量為25 ml)時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量最高(芽孢數(shù)118.6×107個(gè)/g)。這很可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌是好氧菌,料液比大時(shí)水中氧氣含量偏低,滿足不了枯草芽孢桿菌生長(zhǎng),導(dǎo)致枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量減少。相反,料液比小雖然可以滿足枯草芽孢桿菌氧氣需求,但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過小,也影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)。

圖1 料液比對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響Figure 1 Influence of the ratio of feed to liquid on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.2 接菌量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響 由圖2 可以看出,隨著接菌量的增加,發(fā)酵后的花生餅粕混合料中的芽孢桿菌芽孢數(shù)量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),接菌量0.5 g 時(shí)產(chǎn)生的草芽孢桿菌芽孢數(shù)量最多,達(dá)到2.3×107個(gè)/g,隨著接菌量增大,反而抑制枯草芽孢桿菌的繁殖。

圖2 接菌量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響Figure 2 The influence of inoculation amount on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.3 枯草芽孢桿菌種培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢數(shù)量的影響由圖3 看出,枯草芽孢桿菌種培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢桿菌芽孢繁殖有明顯的影響,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),培養(yǎng)時(shí)間在24～36 h 之間時(shí),枯草桿菌繁殖緩慢,芽孢數(shù)量也較少,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),枯草芽孢桿菌的繁殖速度明顯提高,培養(yǎng)時(shí)間到72 h 時(shí)達(dá)到高峰,枯草桿菌芽孢數(shù)為4.53×107個(gè)/g,芽孢桿菌進(jìn)入衰亡期,芽孢數(shù)量明顯下降。

圖3 接菌量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響Figure 3 The influence of temperature on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響 由圖4 可以看出,培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量有明顯的影響,隨著培養(yǎng)溫度升高枯草芽孢桿菌的繁殖先增后降的趨勢(shì),芽孢數(shù)目呈現(xiàn)先升高后培養(yǎng)溫度在30 ℃范圍內(nèi)時(shí),枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量最高,達(dá)到枯草桿菌芽孢數(shù)為28.5×107個(gè)/g。

圖4 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響Figure 4 The influence of temperature on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.5 花生莖葉含量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響

由圖5 可以看出,花生莖葉含量對(duì)枯草芽孢桿菌繁殖有一定影響,但不明顯。花生莖葉添加含量5 g 時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量最多,達(dá)到0.42×107個(gè)/g。這可能與不同的花生莖葉含量改變枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。適合地添加花生莖葉改善了發(fā)酵花生餅粕的透氣性和碳、氮含量,有利于芽孢桿菌生長(zhǎng),否則花生莖葉添加量過多或過少都不利于枯草芽孢桿菌繁殖。

2.2 響應(yīng)面法培養(yǎng)條件優(yōu)化

在花生餅粕以及莖葉的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken 組合設(shè)計(jì),以枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為響應(yīng)值,以加水量、培養(yǎng)時(shí)間、接菌量、培養(yǎng)溫度為自變量因素,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化花生餅粕以及莖葉的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析采用應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

圖5 花生莖葉含量對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量的影響Figure 5 The influence of Stem and leaf content of peanut on the spore quantity of Bacillus subtilis

表1 響應(yīng)面分析因數(shù)與水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Response surface analysis factors and horizontal test design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)所得回歸方程為:

Y=179.00-37.33X1+19.25X2+11.92X3+15.17X4+15.50X1X2-17.75X1X3-34.25X1X4+16.50X2X3-20.75X2X4+24.50X3X4-55.96X12-29.33X22-40.08X32-50.21X42

由表3 可看出,“Prob＞F”值小于0.01,表明回歸方程極顯著,而且各因數(shù)之問差異很顯著,說明該試驗(yàn)方法是可靠有效的。模型R2值為0.9730,失擬項(xiàng)P值為0.0534大于0.05,說明回歸方程擬合程度良好,試驗(yàn)誤差小,可以利用該方程預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的理論數(shù)值。通過比較回歸方程中的各因數(shù)顯著性分析,可判斷各因數(shù)的作用大小,枯草芽孢桿芽孢數(shù)影響的大小依次為加水量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接菌量。

由圖6 可知,響應(yīng)面曲線越陡,相互作用的因素對(duì)花生餅粕、花生莖葉混合飼料中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響越顯著,該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。通過回歸方程可以得到最優(yōu)的預(yù)測(cè)值,即加水量(料液比)1 ∶0.83、培養(yǎng)時(shí)間時(shí)間62.15 h、接菌量0.78、培養(yǎng)溫度30.76 ℃,此條件下枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)理論值195.225。結(jié)合實(shí)際工作,優(yōu)化工藝參數(shù),即加水量(料液比)1 ∶0.83、培養(yǎng)時(shí)間62 h、接菌量0.78、培養(yǎng)溫度30 ℃,枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為195.222±0.003,所得參數(shù)比較為可靠。

表3 枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation of Bacillus subtilis spore quantity

圖6 工藝參數(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量影響的響應(yīng)面Figure 6 Response surface diagram of the influence of process parameters on Bacillus subtilis spore

3 結(jié)論

3.1 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化了各參數(shù),并確定了花生餅粕、花生莖葉混合飼料中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件:加水量(料液比)1 ∶0.83、培養(yǎng)時(shí)間時(shí)間62 h、接菌量0.78 g、培養(yǎng)溫度30 ℃,在該條件下所得枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為(195.222±0.003)。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)影響的大小依次為加水量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接菌量。

3.3 優(yōu)化枯草芽孢桿菌在花生餅粕、花生莖葉混合飼料中培養(yǎng)工藝效果好,培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量較多。為以后的花生餅粕和花生莖葉的利用提供理論依據(jù)。