內(nèi)生真菌對(duì)硝酸鈣脅迫下番茄種子萌發(fā)的影響

葉 鑫王 娜牛世偉張 鑫

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境資源研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110161)

番茄是世界上第二大蔬菜作物[1]。設(shè)施栽培增加了淡季番茄供應(yīng)量,是有效提高單位面積產(chǎn)值的重要生產(chǎn)方式。由于設(shè)施栽培化肥投入過量以及缺少自然淋溶等原因致使土壤次生鹽漬化問題日益嚴(yán)重[2],特別是硝態(tài)氮大量積累,引起土壤酸化,養(yǎng)分失衡,部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法被作物吸收,土壤板結(jié),耕層變淺,通氣透水性差,直接危害作物的正常生長(zhǎng)[3～5]。設(shè)施土壤次生鹽漬化已成為設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸,因此解決設(shè)施土壤次生鹽漬化問題,已成為當(dāng)務(wù)之急。

人們嘗試了各種治理設(shè)施土壤次生鹽漬化問題的途徑,主要包括生物措施、農(nóng)藝措施和工程措施等,而這些措施耗時(shí)較長(zhǎng)、成本較高。植物內(nèi)生菌作為一種微生物資源,它與植物的關(guān)系是互惠共生的,植物為內(nèi)生菌提供能量和營(yíng)養(yǎng)[6];內(nèi)生菌及代謝物能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和提高宿主植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。沈德龍等研究表明水稻內(nèi)生成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)YS19 能分泌4 種不同的植物生長(zhǎng)激素,它們共同調(diào)節(jié)水稻生命活動(dòng),影響水稻乳熟期光合產(chǎn)物的分布[7]。有研究表明,堿脅迫可使強(qiáng)耐堿禾本科植物小花堿茅幼苗體內(nèi)88 種代謝物水平顯著變化,但接種叢枝菌根(AM)真菌后只有31 種組分有變化,顯示逆境下AM 可協(xié)助宿主穩(wěn)定體內(nèi)代謝,提高宿主抗逆性[8]。目前,關(guān)于植物內(nèi)生菌研究主要集中在促進(jìn)作物生長(zhǎng)等方面,而關(guān)于提高作物抗逆方面相關(guān)研究較少,尤其提高番茄適應(yīng)次生鹽漬化相關(guān)研究甚少。為此,本研究從多年連作的設(shè)施番茄植株中分離內(nèi)生真菌并用發(fā)酵液處理番茄種子,在鹽脅迫下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),以篩選出能促進(jìn)種子萌發(fā)的內(nèi)生真菌,為提高番茄適應(yīng)土壤次生鹽漬化和設(shè)施生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 采集樣品 設(shè)施番茄植株和根際土壤樣品采自于多年連作的常規(guī)番茄種植區(qū)和堿地番茄種植區(qū),將采集的樣品裝入自封袋,并立刻放到冰盒中,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA 土豆液體培養(yǎng)基:土豆洗凈去皮,切成小方塊狀,取土豆塊200 g,加入適量水,加熱,沸騰后繼續(xù)煮約30 min,八層紗布過濾。取土豆濾液,葡萄糖20 g,鹽30 g,定容至1 000 ml,pH 自然,分裝滅菌(固體培養(yǎng)基需加1.2%瓊脂粉)[9]。

孟加拉紅液體培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,磷酸二氯鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,葡萄糖10 g,氯霉素0.1 g,孟加拉紅0.033 g,蒸餾水1 000 ml,加熱沸騰溶解,分裝滅菌(固體培養(yǎng)基需加1.2%瓊脂粉)[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植株樣品表面消毒 取番茄根、莖、葉樣品,用自來(lái)水清洗干凈。用流水沖洗樣品1 h 后,分別稱取根、莖、葉樣品0.1 g,置于5%次氯酸鈉中清洗5 min,用無(wú)菌水清洗3 遍,再置于75%乙醇消毒30 s,再用無(wú)菌水清洗3 遍,將沖洗根、莖、葉的無(wú)菌水涂布于PDA 培養(yǎng)基平板上,置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng),觀察平板中菌落的生長(zhǎng)情況,若無(wú)菌落長(zhǎng)出,則說(shuō)明消毒完全[10]。

1.2.2 真菌分離與純化

1.2.2.1 植株內(nèi)生真菌分離與純化 將消毒后的番茄根、莖、葉樣品放入無(wú)菌研缽中,加入少量無(wú)菌石英砂和0.9 ml 無(wú)菌水。研磨后的混合液用無(wú)菌水稀釋10-1至10-6濃度,取0.1 ml 稀釋液均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,28 ℃培養(yǎng),每個(gè)處理3 次重復(fù)。采用平板劃線分離法將新長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接到新的孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,直至獲得單菌落。菌種可選擇短期斜面保存和長(zhǎng)期甘油保存[11]。

1.2.2.2 根際土壤真菌分離與純化 在無(wú)菌操作臺(tái)中,將少量根際土壤樣品放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加入1 ml 無(wú)菌水?dāng)嚢杈鶆?取0.1 ml 土壤渾濁液用無(wú)菌水分別稀釋10-1至10-6濃度,再取0.1 ml 土壤稀釋液均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,28 ℃培養(yǎng),每個(gè)處理3 次重復(fù)。采用平板劃線分離法將新長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接到新的孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,直至獲得單菌落。

1.2.3 真菌發(fā)酵液制備 無(wú)菌條件下,將供試菌株分別接種于PDA 液體培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min 培養(yǎng)5 d,離心取上清,并配置發(fā)酵液濃度為1 mmol/L,備用。

1.2.4 硝酸鹽脅迫濃度篩選 選取飽滿、整齊一致的番茄種子在穴盤中育苗。待苗長(zhǎng)至4～5 葉齡時(shí),選取生長(zhǎng)一致的健壯幼苗,每2 d 分別澆50 ml 的0、15、30、45、60、75、90、120 mmol/L 濃度的Ca(NO3)2,以澆清水為對(duì)照。每個(gè)處理10 穴,3 次重復(fù),隨機(jī)排列。觀察植株長(zhǎng)勢(shì)情況,15 d 后測(cè)定其相關(guān)指標(biāo)。

1.2.5 真菌發(fā)酵液篩選 番茄種子用2%次氯酸鈉溶液,浸泡15 min,然后將種子用去離子水清洗干凈,發(fā)酵液拌種,對(duì)照用同等體積水處理。處理后的種子晾干后,放入裝有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中,加入10 ml 的Ca(NO3)2溶液,25 ℃催芽,統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)至14 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌分離情況

從表1 可以看出,從番茄植株的根、莖和葉片中,分離純化出16 株植物內(nèi)生真菌,其中常規(guī)番茄種植區(qū)分離出9 株,較堿地番茄種植區(qū)多28.6%;從根際土壤中分離純化出54 株真菌,其中常規(guī)番茄種植區(qū)分離出40 株,是堿地番茄種植區(qū)近3 倍。由此可見,常規(guī)番茄種植區(qū)的植物和土壤樣品中獲得真菌數(shù)量均高于堿地番茄種植區(qū),且根際土壤真菌數(shù)量多于植物內(nèi)生真菌數(shù)量。

表1 真菌分離情況

2.2 不同濃度硝酸鈣脅迫對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同濃度硝酸鈣脅迫對(duì)番茄長(zhǎng)勢(shì)的影響 從圖1可以看出,15 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,番茄植株長(zhǎng)勢(shì)較好,葉片呈深綠色,而對(duì)照植株葉片呈淺綠色。30、45、60 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,葉片呈深綠色,但生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。75 mmol/L 硝酸鈣脅迫,部分葉片枯萎,且生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。90、120 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,葉片和根系嚴(yán)重枯萎,甚至死亡?？梢?用高于75 mmol/L 濃度的硝酸鈣脅迫,番茄植株將無(wú)法正常生長(zhǎng)。

2.2.2 不同濃度硝酸鈣脅迫對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響 從圖2可以看出,用不同濃度硝酸鈣處理番茄植株,硝酸鈣濃度越大,植株生長(zhǎng)越緩慢,其中120 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,植株明顯受抑制生長(zhǎng),長(zhǎng)期脅迫甚至導(dǎo)致植株死亡。而用15 mmol/L 硝酸鈣處理番茄植株后,株高、苗鮮重、苗干較對(duì)照低5.10%、10.99%、2.29%,根長(zhǎng)、根鮮重、根干較對(duì)照低9.57%、24.06%、13.42%,硝酸鈣對(duì)番茄植株地上部分影響相對(duì)較小,而對(duì)地下部分影響相對(duì)較大,說(shuō)明硝酸鈣脅迫使根系受損,進(jìn)而影響植株養(yǎng)分吸收。75 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,株高、苗鮮重、苗干較對(duì)照低36.73%、55.39%、38.71%,根長(zhǎng)、根鮮重、根干較對(duì)照低28.14%、66.87%、52.85%,硝酸鈣其對(duì)番茄植株地上部分和地下部分影響均較大,但短期脅迫不會(huì)導(dǎo)致植株死亡。因此,可選擇75 mmol/L 硝酸鈣作為番茄植株生長(zhǎng)的脅迫環(huán)境。

2.3 不同真菌發(fā)酵液對(duì)硝酸鈣脅迫下番茄種子萌發(fā)的影響

從圖3 可以看出,75 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,16 種真菌發(fā)酵液對(duì)番茄種子發(fā)芽影響差異較大。與對(duì)照相比,DL3、DL12、XN11 促進(jìn)了番茄種子萌發(fā),發(fā)芽率分別高于對(duì)照25.73%、29.01%和9.67%,其中DL12 促生效果最好,緩解了鹽堿對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用,而其他真菌發(fā)酵液對(duì)種子發(fā)芽沒有促生作用。

圖1 不同濃度硝酸鈣脅迫下番茄長(zhǎng)勢(shì)

圖2 不同濃度硝酸鈣脅迫對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響

圖3 不同真菌發(fā)酵液對(duì)硝酸鈣脅迫下番茄種子萌發(fā)的影響

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生菌已逐步成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),受到國(guó)內(nèi)外專家的關(guān)注。已有研究證實(shí),內(nèi)生菌在植物體內(nèi)不僅積極地生存著,而且還能產(chǎn)生多種生物學(xué)作用。植物—內(nèi)生菌和諧共生、互利共棲的生命形式,可能是未來(lái)生態(tài)型農(nóng)業(yè)發(fā)展的一條重要思路[12～14]。設(shè)施土壤次生鹽漬化現(xiàn)已成為設(shè)施蔬菜常見問題。植物內(nèi)生菌通過調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)發(fā)育能力,提高對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)的吸收,提高植株的抗逆性,不僅能夠增產(chǎn)增收,還可提高肥料利用率,有效降低養(yǎng)分流失對(duì)環(huán)境的污染。本研究從次生鹽漬化的設(shè)施番茄根莖葉和根際土壤中分離真菌,并用發(fā)酵液處理番茄,以促進(jìn)番茄生長(zhǎng),降低鹽堿對(duì)番茄的傷害。結(jié)果表明,鹽堿脅迫環(huán)境下,從植株和根際土壤中獲得的真菌數(shù)量較少,其中植物內(nèi)生真菌分離出16 株,根際土壤真菌分離出54 株。通過不同濃度硝酸鈣脅迫對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響,篩選出75 mmol/L 硝酸鈣為最佳脅迫濃度。在75 mmol/L 硝酸鈣脅迫下,用不同真菌發(fā)酵液處理番茄種子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DL12 內(nèi)生真菌發(fā)酵液可促進(jìn)番茄種子發(fā)芽,緩解鹽脅迫對(duì)種植萌發(fā)的毒害作用,為設(shè)施生產(chǎn)修復(fù)土壤次生鹽漬化深入研究奠定基礎(chǔ)。