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    2021-07-07 01:52:08王茂鑫陳賢明龔宏勛陳十燕
    東南國防醫(yī)藥 2021年3期
    關(guān)鍵詞:放射線亞組懸液

    王茂鑫,陳賢明,龔宏勛,陳十燕,楊 帆,陳 函

    0 引 言

    鼻咽癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一,我國東南地區(qū)多發(fā),近年來有增多趨勢。放療是鼻咽癌的首選治療方法,但是鼻咽癌的放療抵抗和復(fù)發(fā)仍是鼻咽癌治療中的難點[1-3]。我們的前期工作已發(fā)現(xiàn),抑制鼻咽癌細(xì)胞中環(huán)指蛋白8(ring finger protein 8, RNF8)的表達(dá)能夠提高腫瘤細(xì)胞對放射線的敏感性[4]。但有關(guān)干擾RNF8基因表達(dá)在體內(nèi)是否會提高鼻咽癌的放療敏感性,目前還未見報道。本實驗采用小干擾RNA(small RNA interference,siRNA)沉默CNE1細(xì)胞的RNF8基因,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,注入裸鼠體內(nèi),建立移植瘤模型,探討RNF8與鼻咽癌放療抵抗的關(guān)系及沉默RNF8與鼻咽癌放療敏感性之間的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞和主要試劑鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。RNF8沉默的CNE-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞來自原福州總醫(yī)院[1]。RNF8抗體(美國Santa Cruz公司),共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(ataxia-telangiectasia mutate,ATM)抗體(美國Biovision公司),DNA依賴蛋白激酶催化亞單位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)抗體(美國Thermo公司),異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的兔抗鼠二抗(美國Sigma公司)。AnnexinV-FITC (Abcam, Cambridge, UK)。

    1.1.2 動物BALB/c裸鼠30只購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(實驗動物許可證號:2019-0496);本實驗經(jīng)聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2016-021)。鼠齡3~4周齡,體重12~18 g,均為雄性,在無特定病原體(SPF)、恒定溫度(22~25 ℃)的無菌層流動物房內(nèi)飼養(yǎng),經(jīng)高壓滅菌飼料和水供動物自由食用。

    1.1.3 主要儀器熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司),BCM-1000A型生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司),流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson FAC Sort公司),2100C型直線加速器(美國Varian公司)。

    1.2 方法先用Westernblot法檢測沉默和未沉默RNF8的細(xì)胞中RNF8的蛋白表達(dá),用Image J軟件分析條帶灰度值,計算與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值,驗證siRNA對RNF8的沉默效果。

    1.2.1 裸鼠成瘤取沉默和未沉默RNF8的CNE-1細(xì)胞進(jìn)行實驗,CNE-1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液(臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)占95%以上),用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞懸液為2×106個/0.2 mL,于每只裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液0.2 mL,2周后待腫瘤直徑達(dá)8~10 mm時進(jìn)行實驗。

    1.2.2 成瘤裸鼠放療將成瘤裸鼠30只按隨機(jī)數(shù)字法分為RNF8未沉默組(RNF8+組)和RNF8沉默組(RNF8-組),每組按放療照射劑量的不同又分5個亞組,每個亞組3只,分別給予0、4、8、12、16 Gy照射,其中0 Gy為對照亞組。采用局部分割照射,裸鼠均放入特制容器固定,放置于放療機(jī),照射腫瘤局部,以1 cm厚鉛板防護(hù)動物其余部位,照射距離為100 cm,照射野為4 cm×4 cm,劑量率為78 cGy/min。每次2 Gy。照射完成10 d后殺鼠取瘤,稱重觀察抑瘤情況,計算抑瘤率,公式為:

    抑瘤率=[(對照亞組平均瘤重-每個劑量亞組平均瘤重)/對照亞組平均瘤重]×100%

    1.2.3 將放療后的腫瘤制成單細(xì)胞懸液取2組8 Gy劑量亞組腫瘤組織各約100 mg,在120目的不銹鋼網(wǎng)下方置一平皿,用眼科小剪刀將腫瘤組織剪碎,再用鑷子輕輕在網(wǎng)上搓組織塊,邊搓邊用等滲鹽水沖洗,直至將組織搓完為止。將平皿中的細(xì)胞混懸液用300目銅網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞懸液,以800 r/min離心沉淀2 min(離心半徑15 cm)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL,取0.1mL細(xì)胞懸液,用專用磷酸鹽緩沖液[0.01%磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)]+2 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)洗滌,重懸。

    1.2.4 Annexin V/propidium iodide (PI)雙染檢測RNF8+組8 Gy劑量亞組和RNF8-組8 Gy劑量亞組及其對照亞組凋亡率取100 μL細(xì)胞懸液加入10 μL AnnexinV-FITC, 輕輕搖晃,冰上避光孵育15 min,再加入 10 μL PI冰上避光孵育5 min,然后加入400 μL專用緩沖液制成單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測。空白對照不加Annexin V-FITC+PI。

    1.2.5 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測DNA-PK、ATM的表達(dá)100 μL的RNF8+組8 Gy劑量亞組和RNF8-組8 Gy劑量亞組細(xì)胞懸液加入FC受體10 μL孵育,加入抗體(50 μg/mL)10 μL,4 ℃避光孵育1 h,0.01%PBS洗滌,離心,再加入FITC標(biāo)記二抗,4 ℃避光孵育30 min,1%多聚甲醛固定,500目濾網(wǎng)過濾,重懸,空白對照不加一抗,流式細(xì)胞儀檢測。

    2 結(jié) 果

    2.1 RNF8沉默效果的驗證結(jié)果RNF8在RNF8-組中只有微量表達(dá)(0.11±0.03),而在RNF8+組中表達(dá)明顯升高(1.18±0.23),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

    圖示RNF8+組的RNF8表達(dá)明顯高于RNF8-組

    2.2 放療后2組細(xì)胞在各個劑量點抑瘤率的比較隨著放療劑量的增高,2組的腫瘤均有所縮小,見圖2。RNF8+組抑瘤率在各個劑量點均低于RNF8-組,其中,在8 Gy和12 Gy劑量點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但其中RNF8+組8 Gy劑量亞組和RNF8-組8 Gy劑量亞組差異最大(P<0.01),見表1。

    圖示RNF8+組形成的腫瘤在各個劑量放療后均大于RNF8-組

    表1 RNF8未沉默與沉默成瘤裸鼠在各個放療劑量點的抑瘤率比較

    2.3 放療后2組細(xì)胞的8 Gy劑量亞組凋亡率的比較放療后RNF8+組8 Gy劑量亞組和 RNF8-組8 Gy劑量亞組凋亡率均較各自的對照亞組升高,且RNF8+組8 Gy劑量亞組凋亡率明顯低于RNF8-組8 Gy劑量亞組(P<0.05)。見圖3。

    a:RNF8+組;b:RNF8-組

    2.4 放療后2組細(xì)胞的8 Gy劑量亞組的ATM和DNA-PKcs表達(dá)水平的比較放療后RNF8+組8 Gy劑量亞組ATM的表達(dá)明顯高于RNF8-組8 Gy劑量亞組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);RNF8+組8 Gy劑量亞組DNA-PKcs的表達(dá)亦高于RNF8-組8 Gy劑量亞組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表2 8 Gy放療后RNF8未沉默與沉默裸鼠移植瘤的ATM、DNA-PKcs的表達(dá)比較

    3 討 論

    鼻咽癌的放療后殘留和復(fù)發(fā)與多種因素有關(guān),如腫瘤的分期、大小、侵犯范圍、病理類型有關(guān),但鼻咽癌細(xì)胞對放射線的抵抗亦是重要因素。而這種抵抗是通過對損傷的腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)行修復(fù)實現(xiàn)的。放射線導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷,此時腫瘤細(xì)胞可以激活多種蛋白來修復(fù)損傷的DNA,從而使腫瘤細(xì)胞存活下來,放療停止后,腫瘤細(xì)胞可以再次增殖導(dǎo)致復(fù)發(fā)。研究表明,細(xì)胞主要通過非同源性末端連接(DNA nonhomologous end-joining,NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)兩種途徑來修復(fù)損傷的DNA,DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)是前者關(guān)鍵酶,ATM是后者關(guān)鍵酶[5-8]。而RNF8是一個包含環(huán)指結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶家族成員,在細(xì)胞受到電離輻射時,RNF8泛素化多種底物并募集多種因子至DNA損傷部位,進(jìn)行DNA的修復(fù)[9-13]。Lu等[14]發(fā)現(xiàn)RNF8泛素化多種蛋白使Nijmegen斷裂綜合征1(Nijmegen breakage syndrome, Nbs1)等分子聚集在DNA損傷位點, 通過HR途徑修復(fù)DNA。Wu等[15]發(fā)現(xiàn)RNF8與FHA和環(huán)指檢查點(checkpoint with FHA and ring finger,Chfr)共同調(diào)控ATM的活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)ATM依賴的DNA損傷應(yīng)答。我們前期從細(xì)胞和分子水平的研究表明,RNF8-的鼻咽癌細(xì)胞比RNF8+細(xì)胞對放射線更加敏感,凋亡率更高,即RNF8+細(xì)胞的抵抗力更強(qiáng),表明RNF8參與DNA的損傷修復(fù)。而放療后RNF8+細(xì)胞ATM的表達(dá)較RNF8-細(xì)胞高,表明RNF8激活A(yù)TM為主的HR途徑,導(dǎo)致放療抵抗[4]。本研究還從人鼻咽癌標(biāo)本中檢測RNF8的表達(dá),發(fā)現(xiàn)RNF8陽性者殘留和復(fù)發(fā)的發(fā)生率升高,生存率降低,提示RNF8參與鼻咽癌放療抵抗[16]。

    我們在活體內(nèi)試驗結(jié)果也得出類似結(jié)論。本研究通過對裸鼠移植瘤的研究發(fā)現(xiàn),RNF8-組腫瘤較RNF8+組放療后的生長抑制率高,提示RNF8-組更容易受到放射線損傷,而RNF8+組有放療抵抗,由此可以推論RNF8參與DNA的損傷修復(fù)。在檢測凋亡率的實驗中,RNF8沉默后,放療后腫瘤細(xì)胞凋亡率較RNF8+組明顯升高,進(jìn)一步證實了這一點,即缺少了RNF8, 腫瘤細(xì)胞更容易被放射線殺傷,表明RNF8在腫瘤細(xì)胞的放療抵抗中具有重要作用。進(jìn)一步的研究顯示,RNF8+組放療后ATM表達(dá)升高,而RNF8-組放療后的ATM表達(dá)無明顯變化,即腫瘤的RNF8表達(dá)受抑制后,接受射線照射其ATM表達(dá)也受抑制,表明ATM的表達(dá)是受RNF8調(diào)節(jié)或控制的,提示RNF8通過調(diào)節(jié)ATM,通過HR途徑修復(fù)損傷的DNA。而DNA-PKcs在放療后的RNF8-組和RNF8+組均有所升高,提示DNA-PK可能也參與了DNA的修復(fù),但組間無明顯差異,表明DNA-PK并不受RNF8的調(diào)節(jié),與我們之前的研究結(jié)果有較好的一致性[4]。

    總之,RNF8通過激活以ATM為主的HR途徑來修復(fù)腫瘤細(xì)胞DNA,從而導(dǎo)致腫瘤的放療抵抗。但鼻咽癌的放療抵抗機(jī)制非常復(fù)雜,RNF8激活HR途徑修復(fù)損傷的DNA只是其中的一個方面,這就需要更加深入地研究鼻咽癌的放療抵抗機(jī)制,從而采取針對性的措施,減少放療抵抗,提高腫瘤的放療敏感性,進(jìn)而提高患者生存率。

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