超聲波輔助酶法提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)的工藝研究

薩如拉 文靜 于田田 魯爽 田恬 王思宇 劉敏

摘 要：為了有效提取燕麥麩皮中的蛋白質(zhì)，以燕麥麩皮為原料，測(cè)定蛋白含量、脫脂，以超聲時(shí)間、加水量、加酶量為單因素，使用超聲輔助酶法進(jìn)行提取試驗(yàn)，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白質(zhì)提取率，確定各單因素的最佳提取條件。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，得燕麥麩皮蛋白的最佳提取工藝：超聲時(shí)間60min，加水量60mL，加酶量0.06mg，燕麥麩皮蛋白質(zhì)提取率為最高的31.40%。

關(guān)鍵詞：燕麥麩皮;蛋白質(zhì);提取率;正交試驗(yàn);單因素試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TQ461? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2021）01-0017-04

燕麥?zhǔn)且环N低糖、高蛋白質(zhì)食品，優(yōu)質(zhì)蛋白的含量為11.3%～19.9%，在糧食作物中居首位[1]。燕麥蛋白是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，主要由谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白組成[2]，而燕麥蛋白主要集中在燕麥麩皮中，更重要的是燕麥蛋白中必需氨基酸組成與每日攝取量的標(biāo)準(zhǔn)基本相同，是所有谷物中氨基酸最平衡的食品，可有效地促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育，其中賴氨酸和精氨酸含量較高[3]。同時(shí)，燕麥蛋白的功效比、化學(xué)評(píng)分、生物價(jià)也是植物蛋白中的佼佼者[2]。燕麥麩皮是燕麥加工過程中的副產(chǎn)物，除了一些麩皮作為動(dòng)物飼料以外大部分未被有效利用，會(huì)被焚燒或填埋處理，浪費(fèi)蛋白質(zhì)資源的同時(shí)污染環(huán)境。因此，為了提高燕麥麩皮的附加價(jià)值及優(yōu)質(zhì)蛋白資源的有效利用率，如何從燕麥麩皮中更高效、更合理地提取燕麥蛋白成為研究的首要問題。

目前，國(guó)內(nèi)外研究的燕麥麩皮提取蛋白的方法主要有堿提酸沉法、酶法、超聲波法及復(fù)合法[4-6]。堿提酸沉法利用蛋白質(zhì)在堿性條件易溶，而在酸性條件達(dá)到其等電點(diǎn)而生成沉淀的性質(zhì)，用堿提酸沉達(dá)到分離或提純的目的，是目前植物蛋白生產(chǎn)中常用的方法，但其缺點(diǎn)是使用了大量的酸和堿[7]。酶法具有設(shè)備簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，水解速度快、提取時(shí)間短、提取率高、不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但是卻大大增加了工業(yè)成本并且控制條件也較嚴(yán)格[8]。為了提高提取率，在堿提酸沉和酶解基礎(chǔ)上再加超聲波處理，也有以上這些方法以不同形式復(fù)合的復(fù)合提取方法。

超聲波輔助酶法可以減少酶加量、縮短酶提取時(shí)間，并可以提高蛋白質(zhì)提取率及純度。本研究以提高燕麥麩皮的蛋白質(zhì)提取率、縮短提取時(shí)間、降低提取成本、改善蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值為目的，選用了超聲輔助酶解法來提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)，為提取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料、試劑及儀器設(shè)備

燕麥麩皮、牛血清白蛋白、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、正己烷、氫氧化鈉、乙醇、磷酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、超聲波清洗器、恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)、離心機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定按照GB 5009.5—2010進(jìn)行測(cè)定[9]。

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取10mg牛血清蛋白，溶于100mL蒸餾水中，配成100μg/mL溶液。再稱取100g考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL 90%的乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，蒸餾水定容至1000mL。取6支試管，按表1配制牛血清白蛋白液各1mL。從各試管中吸取0.1mL溶液，分別放入10mL具塞試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，放置2min，在595nm下比色測(cè)吸光值。

2.3 燕麥麩皮的脫脂

稱取一定量的燕麥麩皮加入錐形瓶中，以料液比1：6（g/mL）加入正己烷，室溫下震蕩脫脂3h，過濾，并用冷卻的正己烷沖洗3次，將脫脂的燕麥麩晾干，備用。

2.4 酶的篩選

取3g脫脂燕麥麩皮加入60mL水，所加酶的最適溫度下超聲60min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，加入0.06g酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。每種酶進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)并且取其平均值。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

測(cè)定不同超聲時(shí)間，不同加液量和不同加酶量下燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率，每種因素進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)并且取其平均值。

2.5.1 超聲時(shí)間對(duì)燕麥麩皮蛋白提取率的影響

取3g脫脂燕麥麩皮加入60mL蒸餾水，在45℃下分別超聲30、40、50、60、70min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.5，加入0.06g堿性蛋白酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算提取率。

2.5.2 加水量對(duì)燕麥麩皮蛋白提取率的影響

取3g脫脂燕麥麩皮，分別加入40、50、60、70、80mL蒸餾水，在45℃下超聲60min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.5，加入0.06g堿性蛋白酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算提取率。

2.5.3 加酶量對(duì)燕麥麩皮蛋白提取率的影響

取3g脫脂燕麥麩皮加入60mL蒸餾水，在45℃下，超聲60min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.5，分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10g堿性蛋白酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算提取率。

2.5.4 提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在每個(gè)單因素中選取三個(gè)具有最高提取率的梯度進(jìn)行正交試驗(yàn)，并使用 L9（33）正交設(shè)計(jì)（見表3）。

2.5.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)的最佳組合與正交試驗(yàn)最優(yōu)組合進(jìn)行比較選取提取率高的一組作為最終的提取條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量為15.2%。

3.2 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以A595nm吸光值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為

y=0.9971x+0.0025，R2=0.9901。

燕麥麩皮蛋白提取率（%）

=×100

3.3 酶的篩選

以燕麥麩皮蛋白提取率為指標(biāo)，分別計(jì)算了中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及其混合酶在最佳條件下燕麥麩皮蛋白的提取率，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，燕麥蛋白的最佳用酶為堿性蛋白酶，在單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)中采用堿性蛋白酶為燕麥麩皮蛋白的降解酶。

3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

3.4.1 不同超聲時(shí)間對(duì)燕麥麩皮蛋白提取率的影響

如圖2所示，超聲提取時(shí)間在60min之前，燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率隨著超聲時(shí)間的增加而增加，到60min的時(shí)候達(dá)到最大提取率，再延長(zhǎng)超聲時(shí)間時(shí)提取率變化不大，且略有下降的趨勢(shì)。超聲時(shí)間較短的時(shí)候燕麥麩皮中的蛋白質(zhì)還沒完全提取，超聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)被提取的蛋白質(zhì)可能被破壞而降低提取率。因此，本試驗(yàn)中60min的超聲時(shí)間為最適合的提取時(shí)間。

3.4.2 不同加酶量對(duì)燕麥麩皮蛋白提取率的影響

如圖3所示，加酶量較少的時(shí)候燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率較低，因?yàn)槊肝茨軡M足底物需要的酶量，加酶量增加至0.06mg的時(shí)候提取率最大，說明0.06mg酶正好能滿足底物所需酶量，但酶量繼續(xù)增加的時(shí)候提取率開始下降，可能因?yàn)槊噶窟^度而進(jìn)一步把提取的蛋白質(zhì)降解成氨基酸或短肽而使提取率下降。

3.4.3 不同加水量對(duì)燕麥麩皮蛋白提取率的影響

如圖4所示，燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率隨著加水量的增加而增加，當(dāng)加水量達(dá)到50mL時(shí)，提取率最高可達(dá)30.14%，當(dāng)加水量超過50mL后，提取率有下降的趨勢(shì)。這是由于加水量較小時(shí)，體系黏度較大，不利于傳質(zhì)。但加水量過大時(shí)，酶與底物的接觸概率下降，使蛋白質(zhì)的提取率降低。

3.4.4 正交試驗(yàn)

在燕麥麩皮蛋白質(zhì)提取單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)超聲時(shí)間、加水量、加酶量等三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。進(jìn)一步優(yōu)化超聲輔助酶解法提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)的工藝條件，結(jié)果見表5，從表5中的極差R可知，影響蛋白質(zhì)提取率的因素的主次順序是：超聲時(shí)間>加酶量>加水量，優(yōu)化后的提取工藝條件為A2B3C1，即超聲時(shí)間為60min，加水量為60mL，加酶量為0.06mg，提取率為31.40%。

3.4.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從燕麥麩皮中提取蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)確定的最佳條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，即超聲時(shí)間60min，加水量為50mL，加酶量為0.06mg，提取率為30.14%。蛋白質(zhì)提取正交試驗(yàn)中提取率最高的組合為A2B3C1，即超聲時(shí)間為60min，加水量60mL，加酶量為0.06mg，提取率能為31.40%。因此最佳提取條件為超聲時(shí)間60min，加水量60mL，加酶量0.06mg。

4 結(jié)論

本研究使用超聲輔助酶解法提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定了提取蛋白質(zhì)的最佳工藝，即超聲時(shí)間60min，加水量60mL，加酶量0.06mg，蛋白質(zhì)提取率為31.40%。超聲波輔助酶法可以減少酶加量、縮短酶提取時(shí)間，降低提取成本、改善蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本研究為提取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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〔9〕GB 5009.5-2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定.