咪唑安定通過調(diào)控miR-4458/NF-κB通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

劉愛芬 王輝 王曉鵬天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科 00；天津市公安醫(yī)院外一科 0004；山西白求恩醫(yī)院麻醉科，太原 000

世界衛(wèi)生組織最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年全球結(jié)腸癌死亡病例高達(dá)86萬例，已成為全球第3大常見惡性腫瘤［1］。手術(shù)切除是結(jié)腸癌最有效的治療手段，然而越來越多臨床或基礎(chǔ)研究表明圍術(shù)期麻醉技術(shù)對殘留腫瘤細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的影響是導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)或術(shù)后轉(zhuǎn)移的重要因素［2］。因此，尋找有效的抗癌麻醉藥對改善結(jié)腸癌患者預(yù)后、提高生存率具有重要意義。咪達(dá)唑侖是一種廣泛使用的苯二氮卓類麻醉劑，具有麻醉前給藥、誘導(dǎo)和維持麻醉、治療失眠和癲癇、重癥監(jiān)護(hù)室鎮(zhèn)靜等多種用途。近年來研究發(fā)現(xiàn)，咪唑安定對肝癌、咽鱗癌細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒性作用［3-4］。咪 唑 安 定 通 過 上 調(diào) 微 小RNA（microRNA，miR）-137表達(dá)還可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］。有報道指出，咪達(dá)唑侖可激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制異種移植瘤生長［6］。miR-4458是一種新的抑癌基因，結(jié)腸癌中miR-4458下調(diào)，過表達(dá)miR-4458可抑制癌細(xì)胞增殖、糖酵解和乳酸生成［7］。有研究指出，異丙酚通過上調(diào)miR-4458表達(dá)對肝細(xì)胞進(jìn)展具有抑制作用［8］。然而，咪達(dá)唑侖對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，其機(jī)制是否與調(diào)控miR-4458表達(dá)相關(guān)并不清楚。本研究于2019年12月至2020年10月開展實驗，通過體外實驗分析咪唑安定對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及miR-4458表達(dá)的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；咪唑安定（純度為98%）購于中國上海士鋒生物公司；miR-4458抑制物（anti-miR-4458）及其陰性對照（anti-miR-NC）由中國廣州銳博公司合成；miR檢測試劑盒購于美國Gene Copoeia公司；Transwell小室購于中國南京迅貝生物科技有限公司；核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt，PDTC）、噻唑藍(lán)（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）試劑盒、兔源細(xì)胞周期 素D1（CyclinD1）、基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9多克隆抗體購于中國北京百奧萊博公司；兔源磷酸化的核因子κB p65（phosphorylated nuclear factor kappa Bp65，p-p65）抗體、β激動蛋白（beta-actin，β-actin）單克隆抗體、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購于美國CST公司；鼠源磷酸化的NF-κB抑制蛋白（phosphorylated inhibitor of NF-κB，p-IкBα）單克隆抗體購于美國SCBT公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理和分組 SW620細(xì)胞用含有20.0%胎牛血清的杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）置于37℃恒溫、5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為檢測咪唑安定對SW620細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，分別用含0、25、50、100μM咪唑安定［3］的培養(yǎng)液孵育SW620細(xì)胞48 h，依次記為0μM咪唑安定組、25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組。為證實咪唑安定的抗腫瘤作用與調(diào)控miR-4458表達(dá)有關(guān)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將anti-miR-4458、anti-miR-NC轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染anti-miR-4458、anti-miR-NC后48 h的SW620細(xì)胞分別記為anti-miR-4458組、anti-miR-NC組。用含100μM咪唑安定培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，分為anti-miR-4458+100μM咪唑安定組、anti-miR-NC+100μM咪唑安定組。為證實NF-κB通路的作用，用終濃度為20 pmol/L的PDTC［9］和100μM咪唑安定干預(yù)轉(zhuǎn)染anti-miR-4458細(xì)胞48 h，記為PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定組。按照下述具體步驟檢測miR-4458表達(dá)以及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-4458表達(dá)使用miR提取試劑盒從上述各組細(xì)胞中分離miR，采用miR檢測試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量檢測。miR-4458正向引物5'-AGAGGTAGGTGTGGAAGAA-3'， 反 向 引 物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3；U6正 向 引 物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-△△Ct方 法 分 析SW620細(xì)胞中miR-4458表達(dá)水平。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法檢測細(xì)胞活力 每組取5×103個SW620細(xì)胞接種到96孔板，向各孔內(nèi)加入20μl MTT工作液孵育細(xì)胞2 h，然后每孔添加150μl二甲基亞砜反應(yīng)2 h，震蕩10 min至結(jié)晶溶液。用分光光度儀在570 nm處測定各孔的吸光度（A值）以表示細(xì)胞增殖活力。

1.2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 每組取1×105個SW620細(xì)胞接種于涂有（侵襲測定）或未涂有（遷移測定）基質(zhì)凝膠的上腔室中，培養(yǎng)基為200μl無血清培養(yǎng)基。下腔室中為600μl含10.0%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，采用4.0%多聚甲醛固定膜下表面細(xì)胞，0.2%結(jié)晶紫染色。用倒置顯微鏡觀察200×鏡下細(xì)胞，以隨機(jī)5個視野細(xì)胞數(shù)的均值表示細(xì)胞遷移或侵襲能力。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、p-p65和p-IкBα蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液從不同組SW620細(xì)胞中提取總蛋白。用10.0%SDS-PAGE分離30μg蛋白樣品，并濕法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜封閉后，將 膜 與CyclinD1（1∶300）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶300）、p-p65（1∶1 000）、p-IкBα（200μg/ml）、β-actin抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。然后，用羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)對X線片進(jìn)行顯影、定影。凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目的條帶的凈灰度值（β-actin為內(nèi)參）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。用單因素方差分析和LSD-t檢驗評估多組間差異；用獨(dú)立樣本t檢驗評估兩組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度咪唑安定對SW620細(xì)胞增殖、CyclinD1的抑制作用 與0μM咪唑安定組比較，25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組SW620細(xì)胞增殖活力、CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）。隨著咪唑安定濃度的增加，其對SW620細(xì)胞增殖活力、CyclinD1蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。見圖1和表1。

表1 不同濃度咪唑安定對SW620細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期素D1的抑制作用（n=9）

表1 不同濃度咪唑安定對SW620細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期素D1的抑制作用（n=9）

注：與0μM咪唑安定組比較，a P＜0.05

組別0μM咪唑安定組25μM咪唑安定組50μM咪唑安定組100μM咪唑安定組F值P值A(chǔ)值1.089±0.07 0.843±0.05a 0.611±0.04a 0.527±0.03a 231.994＜0.001細(xì)胞周期素D1 0.83±0.07 0.70±0.05a 0.51±0.03a 0.44±0.03a 123.913＜0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測CyclinD1蛋白相對表達(dá)量

2.2 不同濃度咪唑安定對SW620細(xì)胞遷移和侵襲能力、MMP2、MMP9的抑制作用 與0μM咪唑安定組比較，25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組SW620細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）。隨著咪唑安定濃度的增加，其對SW620細(xì)胞遷移、侵襲、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。見圖2和表2。

表2 不同濃度咪唑安定對SW620細(xì)胞遷移和侵襲的、MMP2、MMP9抑制作用（n=9，）

表2 不同濃度咪唑安定對SW620細(xì)胞遷移和侵襲的、MMP2、MMP9抑制作用（n=9，）

注：與0μM咪唑安定組比較，a P＜0.05；MMP2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP9基質(zhì)金屬蛋白酶

組別0μM咪唑安定組25μM咪唑安定組50μM咪唑安定組100μM咪唑安定組F值P值細(xì)胞遷移數(shù)量179±13.07 147±10.49a 117±8.06a 83±6.13a 158.339＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)量136±9.14 113±8.67a 89±4.71a 61±3.79a 190.933＜0.001 MMP2 0.91±0.07 0.73±0.05a 0.56±0.04a 0.45±0.03a 147.242＜0.001 MMP9 0.76±0.06 0.58±0.04a 0.41±0.03a 0.34±0.02a 195.092＜0.001

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測MMP2、MMP9蛋白相對表達(dá)量

2.3 不同濃度咪唑安定對miR-4458、p-p65、p-IкBα表達(dá)的影響 與0μM咪唑安定組比較，25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組SW620細(xì)胞miR-4458表達(dá)量顯著升高（均P＜0.05），p-p65和p-IкBα蛋白表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）。隨著咪唑安定濃度的增加，其對SW620細(xì)胞miR-4458、p-p65和p-IкBα蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。見圖3和表3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測p-p65、p-IкBα蛋白相對表達(dá)

表3 不同濃度咪唑安定對miR-4458、p-p65、p-IкBα表達(dá)的影響（n=9，）

表3 不同濃度咪唑安定對miR-4458、p-p65、p-IкBα表達(dá)的影響（n=9，）

注：與0μM咪唑安定組比較，a P＜0.05；p-p65為核因子κB p65，p-IкBα為NF-κB抑制蛋白

組別0μM咪唑安定組25μM咪唑安定組50μM咪唑安定組100μM咪唑安定組F值P值miR-4458 1.00±0.08 1.43±0.10a 1.89±0.15a 2.01±0.14a 131.256＜0.001 p-p65 0.83±0.07 0.70±0.05a 0.57±0.04a 0.43±0.03a 107.242＜0.001 p-IкBα 0.71±0.05 0.61±0.04a 0.48±0.04a 0.37±0.02a 130.377＜0.001

2.4 抑制miR-4458表達(dá)可以減輕咪唑安定對結(jié)腸癌細(xì)胞miR-4458、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-4458組SW620細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量顯著升高（均P＜0.05）；與anti-miR-NC+100μM咪唑安定組比較，anti-miR-4458+100μM咪唑安定組SW620細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量顯著升高（均P＜0.05）。見圖4和表4。

表4 抑制miR-4458表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)咪唑安定對結(jié)腸癌細(xì)胞miR-4458、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

表4 抑制miR-4458表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)咪唑安定對結(jié)腸癌細(xì)胞miR-4458、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

注：與anti-miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC+100μM咪唑安定組比較，bP＜0.05；CyclinD1為細(xì)胞周期素D1，MMP2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶9

組別anti-miR-NC組anti-miR-4458組anti-miR-NC+100μM咪唑安定組anti-miR-4458+100μM咪唑安定組F值P值miR-4458 1.00±0.08 0.48±0.03a 1.98±0.13 1.21±0.09b 431.954＜0.001 A值1.093±0.08 1.428±0.11a 0.534±0.04 0.978±0.07b 196.416＜0.001細(xì)胞遷移數(shù)量183±14.55 237±19.76a 87±5.73 173±9.84b 189.490＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)量131±8.14 179±14.12a 65±4.13 143±11.04b 201.546＜0.001 CyclinD1 0.85±0.06 1.37±0.11a 0.43±0.02 0.81±0.06b 272.589＜0.001 MMP2 0.93±0.08 1.58±0.12a 0.48±0.03 0.89±0.08b 264.854＜0.001 MMP9 0.77±0.06 1.11±0.09a 0.36±0.02 0.75±0.05b 231.842＜0.001

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)

2.5 NF-κB抑制劑PDTC可逆轉(zhuǎn)抑制miR-4458對咪唑安定處理的SW620細(xì)胞p-p65、p-IкBα、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2和MMP9的影響 與anti-miR-4458+100μM咪唑安定組比較，PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定組SW620細(xì)胞p-p65、p-IкBα、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05），細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（均P＜0.05）。見圖5和表5。

表5 PDTC可以逆轉(zhuǎn)miR-4458下調(diào)對咪唑安定處理的SW620細(xì)胞p-p65、p-IкBα、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

表5 PDTC可以逆轉(zhuǎn)miR-4458下調(diào)對咪唑安定處理的SW620細(xì)胞p-p65、p-IкBα、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

注：p-p65為核因子κB p65，p-IкBα為NF-κB抑制蛋白，CyclinD1為細(xì)胞周期素D1，MMP2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶9

組別anti-miR-4458+100μM咪唑安定組PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定組t值P值p-p65 0.91±0.07 0.48±0.03 16.939＜0.001 p-IкBα 0.73±0.05 0.34±0.04 18.272＜0.001 A值0.978±0.07 0.547±0.03 16.978＜0.001細(xì)胞遷移數(shù)量173±9.84 76±4.19 27.209＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)量143±11.04 61±4.05 20.919＜0.001 CyclinD1 0.81±0.06 0.43±0.03 16.994＜0.001 MMP2 0.89±0.08 0.46±0.03 15.098＜0.001 MMP9 0.75±0.05 0.39±0.02 20.055＜0.001

圖5 蛋 白 質(zhì) 印 跡 法 檢 測p-p65、p-IкBα、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)

3 討 論

近年來研究表明，麻醉可能會影響患者代謝，加劇圍術(shù)期免疫抑制和炎癥，與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散以及腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)［2］。本研究探討了咪唑安定對結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示咪唑安定可降低SW620細(xì)胞增殖活力，下調(diào)促增殖蛋白CyclinD1表達(dá)，與竇云凌等［10］報道的抗增殖作用相吻合。結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、連續(xù)的多步驟過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要事件［11］。MMP2和MMP9是MMP蛋白家族成員，可降解膠原蛋白和ECM各種成分，MMP2和MMP9表達(dá)改變與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。本研究表明，咪唑安定處理可下調(diào)MMP2和MMP9表達(dá)，降低SW620細(xì)胞遷移和侵襲能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，咪唑安定濃度越高，其對SW620細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)抑制作用越強(qiáng)，這表明咪唑安定對結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有抑制作用。與此發(fā)現(xiàn)一致，洪金全等［13］證實，咪唑安定以劑量依賴方式抑制套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miR作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可影響腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。研究表明，miR-4458在乳腺癌組織、細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，miR-4458下調(diào)增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的增殖活力、遷移和侵襲能力［14］。miR-4458可抑制肺癌細(xì)胞遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）進(jìn)程［15］。敲減細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B反義RNA1對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT進(jìn)展的抑制作用與誘導(dǎo)miR-4458表達(dá)有關(guān)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，咪唑安定可增加SW620細(xì)胞中miR-4458表達(dá)量，暗示咪唑安定的抗腫瘤作用可能與調(diào)控miR-4458表達(dá)有關(guān)。功能實驗表明，轉(zhuǎn)染anti-miR-4458抑制miR-4458表達(dá)可增加SW620細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲能力，上調(diào)CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)咪唑安定對SW620增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

NF-κB是一種普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，由p50、p65和IκBα亞基組成，其激活參與細(xì)胞增殖、炎癥、血管生成和轉(zhuǎn)移，是結(jié)腸癌治療的重要靶點［17］。有研究表明，姜黃素通過激活腺苷酸活化蛋白激酶和抑制NF-κB活化可抑制MMP9表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲［18］。姜黃素通過抑制NF-κB活化可逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT進(jìn)程和遷移［19］。此外，咪唑安定聯(lián)合舒芬太尼通過抑制NF-κB的表達(dá)可抑制炎性反應(yīng)，提高鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效果，減輕急性胰腺炎損傷［20］。本研究表明，咪唑安定處理可抑制p-p65、p-IкBα表達(dá)，抑制NF-κB活化。深入研究表明，使用PDTC抑制NF-κB顯著減弱抑制miR-4458聯(lián)合咪唑安定對SW620增殖、遷移和侵襲的影響，這說明miR-4458/NF-κB途徑是咪唑安定在結(jié)腸癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑。

總之，本研究證實，咪唑安定對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲能力具有抑制作用，其機(jī)制是通過上調(diào)miR-4458表達(dá)、抑制NF-κB活化實現(xiàn)的，這進(jìn)一步揭示了咪唑安定的抗腫瘤機(jī)制，為咪唑安定用于防治結(jié)腸癌提供重要依據(jù)。

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