臨床兒童感染肺炎支原體的臨床分型以及CARDSTX基因的驗(yàn)證

麥榮嘉 黃研 馬丹娟 鄧文喻

廣東省婦幼保健院，廣州 510010

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是一種無細(xì)胞壁、形態(tài)呈高度多樣性、能通過除菌濾器、能在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。MP是呼吸道感染常見的病原體，全年均可致病，以秋冬季節(jié)發(fā)病為主，有一定流行趨勢(shì)，不同地域、季節(jié)發(fā)病率不一，好發(fā)于兒童、青少年［1］。MP感染具有較高的發(fā)病率和臨床意義，但仍是一種被低估的疾病［2］。為了更好地了解MP的流行狀況，分子生物學(xué)分型是監(jiān)測(cè)和調(diào)查的有效方法。目前，快速循環(huán)聚合酶鏈反應(yīng)（rapid-cycle polymerase chain reaction polymerase chain reaction，Rapid-Cycle PCR）能快速、高效地對(duì)MP進(jìn)行臨床分型［3］。近年來，獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDSTX）的發(fā)現(xiàn)，為MP感染引發(fā)免疫損傷提供有力證據(jù)［4-5］。目前國內(nèi)對(duì)MPCARDSTX罕有報(bào)道［6］，而CARDSTX基因序列的研究未見報(bào)道。因此，本研究擬檢測(cè)本院2019年兒童急性呼吸道感染患者M(jìn)P的感染率，并用Rapid-Cycle PCR對(duì)MP臨床菌株進(jìn)行P1基因分型，了解本地區(qū)MP的流行情況；同時(shí)運(yùn)用PCR擴(kuò)增CARDSTX基因，比對(duì)分析標(biāo)準(zhǔn)株M129型與臨床株的CARDS基因序列，了解臨床MP的CARDSTX基因序列保守性。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株M129型（ATCC29342）。支原體液體培養(yǎng)基CM403購自美國Invitrogen公司。

1.2 MP臨床菌株的分離培養(yǎng)和DNA提取

1.2.1 臨床MP的鑒定 本實(shí)驗(yàn)通過收集2019年本院臨床診斷為急性呼吸道感染的住院患兒咽拭子標(biāo)本165例，使用Real-time PCR鑒定MP臨床菌株。使用達(dá)安基因公司的肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒DNA，嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 MP臨床標(biāo)本的處理以及培養(yǎng)［7］對(duì)于鑒定為MP陽性標(biāo)本的前提下，收集相關(guān)患兒的痰液標(biāo)本或者支氣管灌洗液標(biāo)本進(jìn)行MP菌株培養(yǎng)分離。首先，在痰液標(biāo)本加入終濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶，置37℃水浴作用30 min，中間不時(shí)搖動(dòng)3～4次，見痰液標(biāo)本明顯液化即可，再加等量CM403肉湯培養(yǎng)液稀釋培養(yǎng)。而對(duì)于支氣管灌洗液標(biāo)本，12 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑為9.8 cm），離心10 min，倒去上清，取沉淀于3 ml CM403培養(yǎng)液中。再者，將上述樣品置于37℃溫箱培養(yǎng)6 h后，再用0.22μm濾膜針頭式濾菌器濾除雜菌，然后將濾液用CM403肉湯培養(yǎng)液再補(bǔ)足至5 ml，于37℃、5%CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，每日觀察液體培養(yǎng)基顏色變化。若≥4 d時(shí)培養(yǎng)液顏色由紅變黃且清亮不混濁，表明MP生長，陰性對(duì)照無顏色變化；另外取100μl菌液加入1 ml CM403肉湯培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)得到MP純種。使用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒提取菌液的基因組DNA，嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3 MP的臨床分型 根據(jù)MPP1基因多態(tài)性和參考文獻(xiàn)［8-9］合成Rapid-Cycle PCR法的擴(kuò)增引物：P1-40、MPAW2；PnG1S、MPI-A2；PnG2S、PnG2A。引物序列和擴(kuò)增片段大小見表1，合成Rapid-Cycle PCR法的擴(kuò)增引物，行兩輪PCR擴(kuò)增。先用P1-40/MPAW2為外側(cè)引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。然后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用內(nèi)側(cè)引物PnG1S/MPI-A2擴(kuò)增P1-1型（607 bp）；PnG2S/PnG2A擴(kuò)增P1-2型（265 bp）。PCR條件均參照文獻(xiàn)［9］。

表1 Rapid-Cycle PCR法的引物序列

1.4 CARDSTX基因的驗(yàn)證、測(cè)序以及比對(duì) 根據(jù)MP全基因序列（MPN372）設(shè)計(jì)包含CARDSTX基因序列擴(kuò)增片段，用軟件Premier 5.0自行設(shè)計(jì)引物：CARDS-F和CARDS-R，序列長度2380bp（包含CARDS基因序列1760bp）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸20 s，共34個(gè)循環(huán)；最后72℃10 min延伸，終止反應(yīng)。隨機(jī)選取5株MP臨床株的CARDSTX基因擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州艾基生物公司進(jìn)行測(cè)序，并將標(biāo)準(zhǔn)株M129型的CARDSTX基因序列（基因編碼：DQ447750）與臨床株測(cè)序結(jié)果分別進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 鑒定臨床MP標(biāo)本 165例臨床住院兒童急性呼吸道感染咽拭子標(biāo)本中，其中31例（18.79%）熒光PCR信號(hào)陽性（＞5×102copies/ml），見圖1。

圖1 MP臨床株的Rapid-Cycle PCR鑒定

2.2 MP菌株的分離培養(yǎng) 將處理后的MP臨床標(biāo)本接種于CM403液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)果見圖2。MP生長過程中，利用葡萄糖并分解產(chǎn)生酸性代謝物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH發(fā)生改變，使酚紅指示劑由紅色變成橘黃色。最終分離培養(yǎng)獲得臨床MP分離株為25株，其中有6株沒能分離成功。

圖2 MP臨床株在CM403液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)結(jié)果

2.3 MP菌株的Rapid-CyclePCR分型 以P1-40/MPAW2引物擴(kuò)增的第1輪產(chǎn)物為模板，用PnG1S/MPI-A2擴(kuò)增出607 bp的DNA片段為MPP1-1型。結(jié)果顯示，25株MP臨床株均擴(kuò)增出607 bp條帶，說明25株均為P1-1型菌株（圖3）。25株臨床株均未擴(kuò)增出P1-2型265 bp條帶。

圖3 5株MP臨床株Rapid-Cycle PCR分型的鑒定

2.4 MP菌株的CARDSTX基因擴(kuò)增以及測(cè)序 用引物CARDS TX-F/R對(duì)25株臨床株進(jìn)行PCR，均擴(kuò)增出2 380 bp目的片段（圖4）。隨機(jī)選取5株臨床株的CARDS TX基因測(cè)序，并與genbank數(shù)據(jù)庫的M129序列同源性達(dá)99.88%。

圖4 5株MP臨床株CARDSTX基因的鑒定

3 討 論

MP作為嬰幼兒、青少年呼吸道感染的主要病原體之一，感染后臨床表現(xiàn)常無特異性，易于與其他病毒、細(xì)菌所致的呼吸道感染相混淆，且對(duì)抗生素敏感性具有特殊性，所以臨床對(duì)于檢測(cè)MP具有十分重要的意義［1-2，10］。目前，最常用MP分型主要根據(jù)P1基因重復(fù)序列的核酸差異為主要依據(jù)，分為P1-1型和P1-2型［11-12］。由于P1基因含有RepMP 4和RepMP 2/3兩個(gè)重復(fù)序列易發(fā)生基因突變或重組，可導(dǎo)致表面膜蛋白P1氨基酸序列的改變而形成新亞型。根據(jù)報(bào)道，每隔3～7年MP可發(fā)生1次地域流行或爆發(fā)，這與MP的分型轉(zhuǎn)換流行相關(guān)［8］。本試驗(yàn)從本院收集的165例急性呼吸道患者的咽拭子標(biāo)本中共檢出31例MP臨床菌株，陽性率為18.79%。

目前，P1限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、多位點(diǎn)變量數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析（MLVA）、多位點(diǎn)序列分型方法、單核苷酸多態(tài)性、Rapid-Cycle PCR、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜和全基因組測(cè)序分析都被用于MP的分型［13-14］。Rapid-Cycle PCR是MP分型最為實(shí)用的方法之一，并且操作簡(jiǎn)單，得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)通過Rapid-Cycle PCR獲得25株P(guān)1-1型菌株，未檢出P1-2型菌株。分離臨床株在MP感染的致病性中，除了通過表面膜蛋白P1的變異、莢膜樣物質(zhì)的抗吞噬作用等逃避宿主免疫系統(tǒng)的防御外，CARDSTX的發(fā)現(xiàn)對(duì)于了解MP的致病有重要意義。目前發(fā)現(xiàn)CARDSTX是MP感染宿主細(xì)胞的主要毒性蛋白，在促發(fā)氣道炎癥及維持氣道高壓狀態(tài)中扮演重要角色［4-5，12］。Kannan等［4］、Becker等［5］通過研究CARDSTX的編碼基因及其功能，證實(shí)其毒素功能區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)與百日咳毒素蛋白S1相似；其毒素的二磷酸腺苷-轉(zhuǎn)移酶N端殘基就像百日咳毒素蛋白一樣，保留煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合催化基團(tuán)和催化谷氨酸殘基。有研究發(fā)現(xiàn)，P1-2型菌株可以高表達(dá)CARDSTX，相比P1-1型菌株更具有侵襲性。然而本研究通過檢測(cè)25株MP的臨床分離P1-1型菌株，均攜帶CARDSTX基因序列；并根據(jù)測(cè)序結(jié)果，與數(shù)據(jù)庫的M129同源性達(dá)99.88%，說明CARDSTX基因高度保守。而對(duì)于P1-1型菌株與P1-2型菌株CARDSTX表達(dá)差異，還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究收集地區(qū)臨床MP感染菌株，通過Rapid-Cycle PCR分型，了解本地區(qū)MP流行主要以P1-1型為主。并且通過驗(yàn)證MP臨床株的CARDSTX基因，發(fā)現(xiàn)其具有高度保守性，或許能成為MP感染的新靶標(biāo)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。