PCB118誘發(fā)大鼠胰島素抵抗及對(duì)骨骼肌細(xì)胞功能的影響

湯金梅 呂榮 畢亭亭 凌玲 徐曉 黃祺 喬慧瑛 楊緒楓

(蘇州市第九人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215200)

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足或者胰島素不能正常發(fā)揮生理功能的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大威脅人類健康的慢性疾病，是一個(gè)在全國乃至全世界均嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題〔1〕。糖尿病目前發(fā)病原因仍不甚清楚，目前認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素是其主要病因，特別是環(huán)境因素起著越來越重要的作用〔2〕。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)是一種能對(duì)生物或人的生殖、發(fā)育、免疫系統(tǒng)功能起重要影響的化學(xué)物質(zhì)，多氯聯(lián)苯(PCBs)是EEDs的一種，其生物活性極其穩(wěn)定，并具有親脂性，能夠蓄積于肝臟、腎臟、肺等器官的脂肪組織中，并通過食物鏈逐級(jí)的富集，對(duì)人群健康產(chǎn)生重要影響〔3〕。目前有研究表明暴露于低水平的PCB中能夠增加胰島素抵抗及2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)〔4〕。PCB118在PCB中最具代表性，能夠評(píng)估環(huán)境中總的PCB，本課題組前期研究證實(shí)低劑量的PCB118暴露降低了大鼠胰島素敏感性，本課題組將進(jìn)一步探討其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 40只清潔級(jí)體重(200±20)g的健康雄性Wistar大鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。大鼠在SPF級(jí)，(20±2)℃動(dòng)物房飼養(yǎng)，5只/籠，自由飲水、攝食。

1.2主要試劑與儀器 PCB118標(biāo)準(zhǔn)品購于美國AccuStandard公司；葡萄糖試劑盒購于北京中生北控生物科技股份有限公司；糖化血紅蛋白試劑盒購于南京建成生物技術(shù)有限公司；胰島素免疫吸附試劑盒購于美國R&D公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)購于大連寶生生物技術(shù)有限公司；肌醇激酶(IRE)1α、磷酸化(p)-IRE1α、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2、p-JNK1/2、胰島素受體底物(IRS-1)、p-IRS-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)-4及GAPDH購于美國Abcam公司。Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)購于美國Thermo公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀購于Thermo Fisher公司。

1.3動(dòng)物模型的建立〔5〕將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，低、中、高劑量組，每組大鼠10只。低、中、高劑量組大鼠每組分別腹腔注射10、100、1 000 μg/(kg·d)的PCB118(PCB118溶解于玉米油溶液中)，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積的玉米油，每周給藥5 d，連續(xù)13 w。

1.4樣品的制備及相關(guān)指標(biāo)的檢測 大鼠末次給藥禁食5 h后，尾靜脈采血，加入蛋白沉淀劑，離心獲得上清液，根據(jù)試劑盒說明書測定大鼠空腹血糖(FBG)含量。HbA1c的測定方法：通過購自深圳普門科技公司的GH-900Plus全自動(dòng)型糖化血紅蛋白檢測分析儀及配套的試劑進(jìn)行測定，嚴(yán)格遵照說明書的步驟進(jìn)行操作。將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血于抗凝管，3 000 r/min離心15 min取上清液，根據(jù)試劑盒說明書采用空腹血清胰島素(FINs)測定FINs水平。計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=ln〔1/(FBG×FINs)〕。根據(jù)HOMA模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)，IRI=(FINs×FBG)/22.5。同時(shí)將麻醉后的大鼠后肢內(nèi)側(cè)皮膚剪開，使股四頭肌暴露出來，順著股骨方向用眼科剪將肌肉組織剪下來，并保存于-80℃冰箱備測。

1.5Realtime-PCR法檢測骨骼肌組織IRE1-α、JNK1/2、IRS-1及GLUT-4 mRNA的表達(dá) 根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取骨骼肌組織中總RNA，DEPC水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度及濃度，當(dāng)檢測出的RNA純度(OD260 nm/OD280 nm=1.8)良好時(shí)候，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：30℃ 6 min，40℃ 20 min。最后進(jìn)行Realtime PCR分析，預(yù)變性95℃，15 min；變性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法分析mRNA表達(dá)量。

1.6Western印跡檢測細(xì)胞中IRE1α/JNK/IRS-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將骨骼肌組織勻漿并加入含有蛋白酶抑制劑及PMSF的細(xì)胞裂解液裂解30 min，4℃離心，收集上清液。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上樣，進(jìn)行12%十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的BSA室溫下孵育1 h，兔抗IRE1α、p-IRE1α、JNK1/2、p-JNK1/2、IRS-1、p-IRS-1、GLUT-4多克隆抗體溶液4℃過夜孵育，第2天室溫孵育二抗，最后根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒說明書在凝膠成像系統(tǒng)中曝光各蛋白條帶，并分析條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PCB118對(duì)大鼠FBG、FINs及HbA1c的影響 與正常對(duì)照組比較，低、中、高劑量組FBG、FINs及HbA1c均顯著提高(P<0.01)。見表1。

表1 PCB118對(duì)大鼠FNG、FINs及HbA1c的影響

2.2PCB118對(duì)大鼠IRI、ISI的影響 與正常對(duì)照組比較，低、中、高劑量組ISI減低、IRI提高(P<0.01)。見表2。

表2 PCB118對(duì)IRI、ISI的影響

2.3PCB118對(duì)大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號(hào)通路mRNA表達(dá)量的影響 與正常對(duì)照組比較，低、中、高劑量組IRE1α、JNK1/2、IRS-1 mRNA表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)，GLUT-4 mRNA表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)。見表3。

表3 PCB118對(duì)大鼠骨骼肌中IRE1-α/JNK/IRS-1信號(hào)通路mRNA表達(dá)量的影響

2.4PCB118對(duì)大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的影響 與正常對(duì)照組比較，低、中、高劑量組p-IRE1α、p-JNK1/2、p-IRS-1表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)，GLUT-4蛋白表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)。見圖1、表4。

1～4：正常對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖1 PCB118對(duì)大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的影響

表4 PCB118對(duì)大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

2型糖尿病在我國糖尿病人群中約占90%，胰島素缺乏或者抵抗是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制〔6〕。胰島素抵抗主要是指胰島素的靶器官及外周組織對(duì)胰島素敏感性降低，致使胰島素所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)降低，而機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，代償性地促進(jìn)胰島素分泌，所導(dǎo)致的高胰島素血癥。其中長期的高血糖將使機(jī)體的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝異常，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，因此FBG是反映糖尿病嚴(yán)重程度及恢復(fù)程度的直接指標(biāo)。HbA1c在一定時(shí)間內(nèi)與血糖濃度呈相關(guān)關(guān)系，能反映機(jī)體的血糖水平。FINs最重要的功能是調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平，能使機(jī)體血糖濃度不管是餐后還是饑餓狀態(tài)均處于一定范圍內(nèi)。因此一定程度上的調(diào)控2型糖尿病患者糖代謝及胰島素敏感性對(duì)于疾病的預(yù)防及治療具有重要作用。

PCB118是PCBs中最持久的一種同系物，是評(píng)估環(huán)境中總PCBs的直接指標(biāo)。PCB118普遍存在于我國長江三角洲的水、土壤、水生生物及泥樣中，也存在于江蘇南部的土壤樣本中，同時(shí)在人體的組織及母乳中也發(fā)現(xiàn)一定的含量。在市售禽類食品中，PCB118也是PCBs中含量最大的單體。而且研究還表明PCB118的暴露對(duì)于人體生殖系統(tǒng)、皮膚功能、免疫系統(tǒng)及行為改變具有顯著的影響。在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，PCB118和PCB138(非二噁英PCB)能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，并增加脂質(zhì)滴的大小。腹腔注射給予C57BL/6小鼠PCB118或PCB138，也能顯著增加脂肪質(zhì)量和脂肪細(xì)胞大小。同時(shí)兩種PCB在體內(nèi)外都能顯著誘導(dǎo)胰島素抵抗，抗糖尿病藥物二甲雙胍能減輕PCB誘導(dǎo)的胰島素抵抗〔7〕。且本課題組前期研究證實(shí)低劑量的PCB118暴露降低了大鼠胰島素敏感性〔8〕，所以本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討PCB118對(duì)大鼠胰島素抵抗的作用，結(jié)果表明PCB118顯著提高大鼠FBG、FINs、HbA1c含量及IRI，減低ISI，進(jìn)而說明PCB118能誘發(fā)大鼠胰島素抵抗。

骨骼肌、肝臟、脂肪是胰島素抵抗發(fā)生的主要靶器官，人體80%葡萄糖的攝取和消耗均是通過骨骼肌實(shí)現(xiàn)的，因此骨骼肌作為胰島素抵抗的主要靶器官在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用〔9〕。在生理?xiàng)l件下，胰島素與骨骼肌細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合，使IRS-1磷酸化，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，并引發(fā)后續(xù)一系列蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使GLUT-4移位到細(xì)胞膜上，葡萄糖從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，最終完成胰島素刺激的骨骼肌細(xì)胞葡萄糖的攝取。在整個(gè)過程中主要涉及IRS-1被激活后所引起的生物學(xué)反應(yīng)。研究顯示PCB代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)折疊、翻譯、合成的重要場所，因此對(duì)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)起著重要調(diào)節(jié)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與肝臟、肌肉的胰島素抵抗密切相關(guān)。研究顯示ERS發(fā)生后，能夠迅速激活I(lǐng)RE1α，進(jìn)而激活JNK信號(hào)通路，被激活的JNK信號(hào)通路能夠通過一系列激酶反應(yīng)使IRS1發(fā)生磷酸化，阻斷胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，抑制胰島素生物學(xué)效應(yīng)，使胰島素抵抗發(fā)生。IRE1是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，由兩個(gè)亞型，分別為IRE1α、IRE1β。其中IRE1β緊存在于腸上皮細(xì)胞，而IRE1α能夠廣泛存在于各種細(xì)胞中，并具有激酶和內(nèi)切酶活性，在ERS主導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。JNK是一種絲裂原蛋白酶激酶家族的主要成員之一，由三個(gè)亞型，分別為JNK1、2、3。JNK1、2能夠廣泛存在于人體各種細(xì)胞中，而JNK3則只表達(dá)于睪丸、心臟、腦組織中。被活化后的JNK能夠激活I(lǐng)RS1在絲氨酸307位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，并減弱胰島素的敏感性。研究顯示胰島素能夠通過激活I(lǐng)RE1-α刺激X盒結(jié)合蛋白1(Xbp1s)生成，Xbp1s進(jìn)一步提高IRS-1及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平，進(jìn)而增加了過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)γ活性、GLUT4在細(xì)胞表面的易位及脂肪細(xì)胞中葡萄糖的攝取〔10〕。有研究也表明短期暴露于PCB118，能提高小鼠循環(huán)三酰甘油水平，同時(shí)也觀察不到炎癥因子的變化，但在肝臟組織及脂肪組織中發(fā)現(xiàn)脂素基因(LIPIN)1和GLUT4表達(dá)的下調(diào)〔5，11〕。因此本研究進(jìn)一步探討PCB118對(duì)IRE1α/JNK/IRS-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果表明PCB118能顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中IRE1α、JNK1/2、IRS-1表達(dá)，下調(diào)GLUT-4表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)大鼠胰島素抵抗。