乙醛脫氫酶2抑制4-HNE對(duì)心肌梗死模型大鼠的影響及作用機(jī)制

余永紅 楊柳 杜艷華

(武漢市第四醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430000)

目前臨床中主要是通過減小患者心肌梗死的面積來達(dá)到治療心肌梗死的目的，從而減輕患者心肌損傷程度，降低患者死亡率〔1〕。心肌梗死患者主要的臨床癥狀是胸骨后疼痛，大部分患者會(huì)伴有心律失常、心力衰竭等并發(fā)癥。數(shù)據(jù)顯示，我國每年會(huì)新增60萬例左右的心肌梗死患者，因此尋找安全有效的治療方式至關(guān)重要〔2〕。乙醛脫氫酶(ALDH)2屬于一種氧化乙醛酶主要存在于線粒體中，促織乙醛形成乙酸，并且對(duì)4-羥基壬烯醛(HNE)有分解作用，能夠降低毒性醛類對(duì)細(xì)胞的損傷。相關(guān)研究指出，ALDH2活性減弱會(huì)阻礙乙醛分解，提高機(jī)體中乙醇代謝產(chǎn)物的濃度，造成乙醛在血液中凝聚，通過刺激肥大細(xì)胞，促使血管中活性物質(zhì)釋放，導(dǎo)致患者臉紅、發(fā)音困難、低血壓、出汗等癥狀發(fā)生〔3,4〕。4-HNE是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)重要的醛基產(chǎn)物，在心肌中是主要的代謝酶抑制，促進(jìn)破壞性蛋白在線粒中聚積，誘導(dǎo)產(chǎn)生ATP，對(duì)開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔有促進(jìn)作用〔5〕。本文旨在研究ALDH2抑制4-HNE對(duì)心肌梗死模型大鼠的影響及作用機(jī)制，為其臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。

1 對(duì)象與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：32只SD健康雄性大鼠，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，大鼠動(dòng)物合格證號(hào):11401500014592。鼠齡8～10周齡，平均(9.8±1.2)周齡，體重200～220 g,平均(210.4±5.2)g。所有大鼠在無病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，飲用水和食物均進(jìn)行過消毒。本文研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：鼠抗人c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、p53單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2方法

1.2.1心肌梗死模型建立 參考靳文學(xué)等〔6〕文獻(xiàn)，并進(jìn)行適當(dāng)修改。選取24只大鼠建立心肌梗死模型，具體操作步驟：使用濃度1%的40 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，進(jìn)行常規(guī)消毒后固定，氣管插管，使用動(dòng)物呼吸機(jī)維持大鼠呼吸，選擇大鼠左胸第3和4段肋骨用剪刀橫切，再用鑷子分離后打開胸腔，使心臟充分暴露。心包膜剪開后，使用10號(hào)醫(yī)用縫合線將冠狀動(dòng)脈前支結(jié)扎，待心臟搏動(dòng)減弱，Ⅱ?qū)?lián)心電圖開始變化，ST段出現(xiàn)明顯上抬，直到抬高到弓背向上，即為造模成功。分為模型組、ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組各8只，正常組8只。

1.2.2心功能指標(biāo)檢測 采用超聲心動(dòng)圖檢查大鼠的心功能，10%的水和氯醛溶液0.3 ml/kg進(jìn)行腹腔注射，大鼠麻醉后，采取仰臥固定的方式在操作臺(tái)上進(jìn)行。使用Vivid7超聲儀檢查大鼠舒張末期左心室后壁厚度(LVPWD)、舒張末期室間隔厚度(IVSD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)指標(biāo)。

1.2.3病理學(xué)觀察 所有大鼠在禁食和禁水后，斷頭處死，立即提取大鼠心肌組織標(biāo)本，使用40 ml/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣6 w，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將四組大鼠心肌細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)融合，當(dāng)細(xì)胞融合率在75%左右時(shí)，行胰酶消化，胰酶消化后終止消化(在新鮮的培養(yǎng)劑中)，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測量終止消化后的細(xì)胞，測量出細(xì)胞密度后，將細(xì)胞種植于六孔板中，每個(gè)六孔板中大約種植4×105個(gè)細(xì)胞，加至新鮮的培養(yǎng)基中(3 ml)，之后進(jìn)行孵育培養(yǎng)，在5%CO2、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞孵育到融合率在40%～80%時(shí)，取1.5 μl的質(zhì)粒DNA溶于100 μl的雙抗培養(yǎng)基中(不含血清)，之后進(jìn)行充分混合，混合均勻后進(jìn)行離心處理至EP管底，在EP管中加入12 μl的PolyFect Reagent，進(jìn)行上下重復(fù)顛倒，顛倒5次，進(jìn)行混勻處理，在室溫環(huán)境下進(jìn)行靜置，靜置時(shí)間5～10 min，對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成起到促進(jìn)作用，之后吸去置于六孔板中的培養(yǎng)基，將新鮮的完全培養(yǎng)基加入(3 ml)，在含有轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μl完全培養(yǎng)基，行上下重復(fù)顛倒，顛倒2次，再次加入六孔板中，之后進(jìn)行水平搖晃，以促進(jìn)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的均勻分布。之后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行常規(guī)的換液處理，再次繼續(xù)24 h的培養(yǎng)，倒置，使用熒光顯微鏡下對(duì)熒光亮度進(jìn)行觀察，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，提取細(xì)胞RNA，鑒定轉(zhuǎn)染效率，將轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養(yǎng)皿中(PCR驗(yàn)證篩選)，將40 μl嘌呤霉素加入每孔后常規(guī)培養(yǎng)，在對(duì)其培養(yǎng)3 d后將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液棄去，選取經(jīng)過PCR驗(yàn)證篩選的細(xì)胞進(jìn)行消化處理后稀釋，稀釋后接種在24孔板中，最終建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組。

1.2.54-HNE水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各組4-HNE水平。

1.2.6心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積 采用流式細(xì)胞儀檢測，將各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，將細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化5 min至細(xì)胞瓶表面呈霧狀，磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打下來，4℃ 2 000 r/min 3 min，PBS洗滌、離心、重懸2次，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。將大鼠心肌組織制作切片在1%的TTC溶液中，37℃孵化，每7～8 min翻動(dòng)1次，染色15 min后使用生理鹽水清洗，使用氯化三苯基四氮唑法(TTC)法檢測大鼠心肌梗死面積。

1.2.7Western印跡檢測JNK、ERK、p53蛋白表達(dá) 將采集到的細(xì)胞，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取蛋白質(zhì)定量法(BCA)進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，通過蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(JNK、ERK、p53按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(JNK、ERK、p53按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入電化學(xué)發(fā)光液，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ALDH2抑制4-HNE對(duì)心肌梗死模型大鼠心功能的影響 與正常組相比，模型組、ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組LVDd、LVDs、LVPWD、IVSD水平升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組LVDD、LVDS、LVPWD、IVSD水平顯著降低(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達(dá)組LVDd、LVDs、LVPWD、IVSD水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組心功能水平、4-HNE水平及肌細(xì)胞凋亡情況比較

2.2各組大鼠病理組織觀察 正常組心肌細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞核保持完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組心肌細(xì)胞發(fā)生皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表現(xiàn)為空泡化，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完全消失，染色質(zhì)連接成波浪狀。ALDH2沉默組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹，并且表現(xiàn)為空泡化；ALDH2過表達(dá)組心肌細(xì)胞結(jié)果得到顯著的改善。見圖1。

圖1 各組病理組織觀察(HE，×200)

2.3各組4-HNE水平比較 如表1所示，與正常組相比，模型組、ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組4-HNE水平升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組4-HNE水平顯著降低(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達(dá)組4-HNE水平顯著降低(P<0.05)。

2.4ALDH2抑制4-HNE對(duì)心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積的影響 如表1所示，與正常組相比，模型組、ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積顯著降低(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達(dá)組心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積顯著降低(P<0.05)。

2.5ALDH2抑制4-HNE對(duì)心肌梗死模型大鼠作用機(jī)制研究 如表2、圖2所示，與正常組相比，模型組、ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組JNK、ERK蛋白表達(dá)升高，p53蛋白表達(dá)顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達(dá)組、ALDH2沉默組JNK、ERK蛋白表達(dá)顯著降低，p53蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達(dá)組JNK、ERK蛋白表達(dá)顯著降低，p53蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠JNK、ERK、p53蛋白表達(dá)水平比較

圖2 Western印跡檢測JNK、ERK、p53蛋白表達(dá)

3 討 論

目前心肌梗死發(fā)病相關(guān)機(jī)制尚未明確，臨床中治療心肌梗死的方式主要包括抗凝、抗血小板、溶栓以及心肌再灌注等治療方式，雖然能夠降低患者心肌梗死的面積，但是對(duì)患者的心肌也產(chǎn)生不同程度的損傷，患者出現(xiàn)的并發(fā)癥較多，治療效果不理想〔7,8〕。因此尋找合適的治療手段對(duì)患者來說意義重大。

本研究結(jié)果說明ALDH2過表達(dá)能夠改善大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)水平，促進(jìn)大鼠心功能恢復(fù)。本文通過病理學(xué)觀察，模型組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細(xì)胞浸潤，并且局灶性梗死瘢痕大面積出現(xiàn)，心肌纖維也發(fā)生斷裂，說明模型建立成功，與楊曉華等〔9〕研究結(jié)果保持一致。研究顯示，在心肌梗死發(fā)生后機(jī)體中產(chǎn)生的氧自由基，對(duì)生物膜磷脂不飽和脂肪酸脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致復(fù)雜產(chǎn)物及新自由基產(chǎn)生〔10,11〕。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中主要產(chǎn)生的物質(zhì)是醛基產(chǎn)物，會(huì)增加自由基的穩(wěn)定性，促進(jìn)氧自由基向細(xì)胞中擴(kuò)散，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。江玲等〔12〕研究指出，4-HNE能夠?qū)€粒體的活性產(chǎn)生破壞作用，造成線粒體發(fā)生線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞修復(fù)大分子損傷能力降低。因此抑制4-HNE水平，能夠減緩心肌損傷程度，對(duì)心肌梗死患者來說至關(guān)重要。4-HNE屬于一種較強(qiáng)的細(xì)胞毒素，能夠抑制心肌收縮力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，4-HNE能夠誘導(dǎo)心律失常，在心肌缺血發(fā)生后，會(huì)造成機(jī)體產(chǎn)生組織損傷〔13〕。本研究結(jié)果說明ALDH2過表達(dá)抑制4-HNE水平顯著，降低心肌梗死后4-HNE產(chǎn)生，與Li等〔14〕研究結(jié)果一致。

ALDH2在4-HNE中發(fā)揮著酯酶和還原酶的作用，通過ALDH2能夠降低4-HNE毒性，從而減輕對(duì)心肌的損傷〔15〕。研究指出，將低乙醛及4-HNE水平，有助于提高機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程有緩解作用，從而降低心肌梗死的面積，避免心肌肥厚和收縮功能障礙產(chǎn)生〔16,17〕。本研究結(jié)果說明ALDH2過表達(dá)能夠減少心肌細(xì)胞凋亡及減少心肌梗死面積。p53是一種凋亡誘導(dǎo)蛋白，在4-HNE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。ERK和JNK屬于重要的絲裂原活化蛋白激酶，在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，通過活化ERK和JNK能夠?qū)53激活，對(duì)p53蛋白表達(dá)起到上調(diào)作用〔18,19〕。本文結(jié)果說明ALDH2過表達(dá)能夠下調(diào)JNK、ERK蛋白表達(dá)，上調(diào)p53蛋白表達(dá)。Yang等〔20〕研究也顯示，采用4-HNE刺激大鼠心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，JNK、ERK活化，表達(dá)升高，本研究與其研究一致。

綜上所述，過表達(dá)ALDH2能夠抑制4-HNE水平，改善心肌梗死大鼠心功能狀況，通過調(diào)控JNK、ERK、p53相關(guān)蛋白，能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡,為其臨床治療提供新的治療思路。