東勝砂巖型鈾礦床中細(xì)菌多樣性研究

耿 海 波

(石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081)

成礦作用是指在地球的演化過(guò)程中，使分散存在的有用物質(zhì)(化學(xué)元素、礦物、化合物)富集而形成礦床的各種地質(zhì)作用[1].人們對(duì)于成礦作用的研究多側(cè)重于物理因素和化學(xué)因素，雖然生物因素在成礦作用中的研究正逐漸受到重視，但仍有大量的生物礦化機(jī)制未被闡明[2].鈾既是一種高效清潔的能源，又是一種關(guān)系到國(guó)家安全的戰(zhàn)略資源.長(zhǎng)期以來(lái)，人們將鈾的成礦作用視為由硫化物、氫氣或其他還原劑通過(guò)物理和化學(xué)作用還原U(VI)所致，認(rèn)為即使存在生物成礦因素，也只起間接作用[3].文獻(xiàn)[4]揭示了某些細(xì)菌能夠?qū)(VI)還原為U(IV) ，開(kāi)辟了研究鈾和微生物相互作用的新時(shí)代.為重新認(rèn)識(shí)砂巖中卷型礦床的成礦機(jī)制，掀起了旨在修復(fù)鈾污染水環(huán)境的鈾-微生物作用的實(shí)驗(yàn)研究熱潮[5-6].國(guó)外有關(guān)鈾生物成礦作用的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在微生物與有機(jī)質(zhì)的關(guān)系(間接成礦)、微生物富集鈾(直接成礦)的人工合成實(shí)驗(yàn)等方面[7-9].國(guó)內(nèi)對(duì)于鈾的生物成礦作用的研究主要集中在新疆十紅灘砂巖型鈾礦上，對(duì)于鄂爾多斯盆地北部東勝鈾礦的生物成礦研究主要集中在鈾礦石中微化石推論[10]和脂肪酸生物標(biāo)志的間接推斷[11]上，但這些研究均利用巖石樣品的間接生物檢測(cè)指標(biāo)對(duì)鈾的生物成礦作用進(jìn)行推測(cè)，缺乏活體微生物參與成礦的直接證據(jù).利用微生物學(xué)方法研究鈾礦床的不同區(qū)域巖石中存在的微生物種類及其分布規(guī)律，并結(jié)合其生理、生化特點(diǎn)研究微生物和礦床之間的相互作用，是探究生物成礦作用的主要方法之一.本文對(duì)東勝砂巖型鈾礦不同區(qū)域巖石采樣后，通過(guò)對(duì)其中細(xì)菌的富集、分離，來(lái)鑒定礦床中存在的各類活體細(xì)菌，研究其種類和分布規(guī)律，并對(duì)產(chǎn)生此分布規(guī)律的原因進(jìn)行探討，以確定此鈾礦床中的優(yōu)勢(shì)菌群，為進(jìn)一步開(kāi)展鈾的生物成礦作用研究提供技術(shù)參數(shù).

1 材料與方法

1.1 巖石采樣與處理

在鄂爾多斯盆地北部東勝砂巖型鈾礦的不同區(qū)域用無(wú)菌采樣裝置進(jìn)行采樣，將樣品置于無(wú)菌采樣袋中，送生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌體的富集、分離與純化，并進(jìn)行鑒定.

樣品取回后，在超凈工作臺(tái)用無(wú)菌刀剝除2 cm厚巖石表層，去除巖石樣品表面的污染物，取巖芯部分在研缽中研磨至沙礫狀，定量稱取后置于不同的培養(yǎng)液中，在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行富集培養(yǎng).

本研究所用6個(gè)代表性的巖石樣品，分別采自鄂爾多斯盆地北部東勝地區(qū)中侏羅系直羅組的各個(gè)亞帶，樣品的基本地球化學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1.

表1 樣品特征一覽表

1.2 各類細(xì)菌培養(yǎng)基的配制[12]

1.2.1 硫酸鹽還原菌(STK)

磷酸氫二鉀0.05 g、氯化銨0.10 g、硫酸鈉0.10 g、二水氯化鈣0.01 g、七水硫酸鎂0.20 g、 70%的乳酸鈉溶液0.5 mL、蒸餾水100 mL，pH值控制在7.5.單獨(dú)配制含量為1%的硫酸亞鐵銨溶液，在使用培養(yǎng)基前，加5 mL至培養(yǎng)基內(nèi).

1.2.2 鐵細(xì)菌

硝酸銨0.05 g、硝酸鈉0.05 g、磷酸氫二鉀0.05 g、七水硫酸鎂0.05 g、六水氯化鈣0.02 g、檸檬酸鐵銨1.00 g、蒸餾水100 mL，pH值控制在7.0.

1.2.3 氧化硫硫桿菌

硫酸銨0.02 g、磷酸二氫鉀0.30 g、七水硫酸亞鐵0.001 g、七水硫酸鎂0.05 g、氯化鈣0.03 g、蒸餾水100 mL、硫磺粉1.00 g，pH值控制在3.0.

1.2.4 排硫硫桿菌

五水合硫代硫酸鈉0.50 g、氯化銨0.01 g、碳酸氫鈉0.10 g、磷酸氫二鈉0.02 g、六水合氯化鎂0.01 g、蒸餾水100 mL，pH控制在7.0.五水合硫代硫酸鈉和碳酸氫鈉單獨(dú)用少量水溶解后滅菌，使用前再加入到其他已滅菌的成分中.

1.2.5 氧化亞鐵硫桿菌

硫酸銨0.015 g、氯化鉀0.005 g、磷酸二氫鉀0.05 g、七水硫酸鎂0.05 g；硝酸鈣0.001 g、蒸餾水100 mL、10%的七水硫酸亞鐵1 mL，pH值控制在3.0.

1.2.6 亞硝化細(xì)菌

硫酸銨0.20 g、磷酸二氫鉀0.10 g、七水硫酸鎂0.05 g、氯化鈉0.20 g、七水硫酸亞鐵0.04 g、碳酸鈣0.50 g、蒸餾水100 mL，pH值控制在7.2.

1.2.7 硝化細(xì)菌

硝酸鈉0.10 g、無(wú)水碳酸鈉0.10 g、氯化鈉0.05 g、磷酸二氫鉀0.05 g、七水硫酸鎂0.05 g、七水硫酸亞鐵0.04 g、蒸餾水100 mL，pH值控制在7.5.

1.3 各類細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法

1.3.1 硫酸鹽還原菌

分別取10 g，1 g，0.1 g粉碎后的巖石樣本，接種到100 mL培養(yǎng)基中，每一添加量平行接種到5根試管中，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).隔氧培養(yǎng)5 d后記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為陽(yáng)性的試管數(shù)，查MPN(most probable number，譯為最可能數(shù))檢索表，計(jì)算單位質(zhì)量巖石樣本中的微生物MPN值[13].

1.3.2 其他細(xì)菌

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù).

1.4 各類細(xì)菌的富集、分離和純化[12]

1.4.1 硫酸鹽還原菌

稱取無(wú)菌粉碎后的巖石樣品10 g，加入對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)，產(chǎn)生黑色沉淀現(xiàn)象的可判斷為硫酸鹽還原菌陽(yáng)性.取1 mL菌液，接種到無(wú)硫酸亞鐵銨的液體培養(yǎng)基中，隔氧培養(yǎng)5 d后，用混合倒平板的方式接種到固體培養(yǎng)基中，隔氧密封，置28 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察出現(xiàn)黑色菌落后，挑取單菌落得到純培養(yǎng).

1.4.2 鐵細(xì)菌

稱取無(wú)菌粉碎后的巖石樣品10 g，加入對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中，避光恒溫18 ℃～20 ℃培養(yǎng)7 d～10 d，直至出現(xiàn)松軟的灰色絮狀物，當(dāng)灰色絮狀物變?yōu)轸鼽S色后制成水浸片，在蓋玻片上加濃度為2%的鐵氰化鉀和10%鹽酸溶液各一滴，用濾紙吸去多余水分后放大1000倍鏡檢，若菌體呈藍(lán)色，則證明所培養(yǎng)物為鐵細(xì)菌.采用固體平板連續(xù)劃線的方法將其分離純化，得到的單菌落移接入固體斜面培養(yǎng)基中保存.

1.4.3 硫桿菌

稱取無(wú)菌粉碎后的巖石樣品10 g，加入到對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中，在28 ℃富集培養(yǎng)7 d～10 d，將分離得到的硫桿菌接種到硅膠固體平板上，挑取單菌落得到純培養(yǎng).

1.4.4 硝化細(xì)菌

稱取無(wú)菌粉碎后的巖石樣品10 g，分別接種到亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d～10 d.將分離得到的細(xì)菌分別接種到硅膠固體平板上，挑取單菌落得到純培養(yǎng).

1.5 各類細(xì)菌的鑒定

按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 巖石樣品中細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 硫酸鹽還原菌

在不同巖石樣品中加入培養(yǎng)基，經(jīng)無(wú)氧培養(yǎng)后，產(chǎn)生黑色菌落，挑取單菌落分離、純化得到硫酸鹽還原菌.鏡檢其形態(tài)為桿狀或弧狀，Gram染色呈陰性，它可將硫化物還原產(chǎn)生H2S，其最適宜生長(zhǎng)溫度為37 ℃.依據(jù)文獻(xiàn)[14]，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行觀察和理化性質(zhì)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2-3.

表2 脫硫弧菌屬特征與分離菌株

表3 脫硫腸狀菌屬特征與分離菌株

由表2-3可以看出，各亞帶巖石樣品中存在分屬于脫硫弧菌屬和脫硫腸狀菌屬的硫酸鹽還原菌.其中，脫硫弧菌屬分布在氧化帶和弱氧化帶，而脫硫腸狀菌屬的東方脫硫腸狀菌在3個(gè)亞帶均有分布.究其原因在于，脫硫腸狀菌在特殊環(huán)境下可以形成抗逆性極強(qiáng)的芽孢，有利于菌體適應(yīng)外界的高溫、高壓、輻射、毒性等不良環(huán)境，為菌體于礦床中生存提供保障.脫硫腸狀菌在東勝砂巖型鈾礦和新疆十紅灘砂巖型鈾礦中的分布情況[15]有相似之處.

另外，菌體的分布和礦石的品位也有一定的關(guān)聯(lián).所采巖石樣品含鈾量較高，而鈾的放射性可能會(huì)影響硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)和繁殖；巖石中的含碳量低，能在很大程度上抑制硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，所以菌體種類較少.

微生物的分布和環(huán)境因素也有相互作用.硫酸鹽還原菌對(duì)礦床的形成和礦床中鈾含量對(duì)硫酸鹽還原菌的影響這兩方面誰(shuí)起更主要的作用，尚有待進(jìn)一步探討.

2.1.2 鐵細(xì)菌

鐵細(xì)菌可以利用Fe(Ⅱ)為營(yíng)養(yǎng)，將之氧化成Fe(Ⅲ)，從而形成高價(jià)鐵離子，進(jìn)而導(dǎo)致沉淀出現(xiàn)，并從中獲得自身生長(zhǎng)所需要的能量.筆者從不同巖石樣品中分離得到了多株菌落特征明顯的鐵細(xì)菌，對(duì)其形態(tài)進(jìn)行鏡檢，并根據(jù)文獻(xiàn)[14]對(duì)其進(jìn)行鑒定至屬，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 鐵細(xì)菌的特征與分類

由表4可以看出，鐵細(xì)菌在礦床中的分布比較普遍，尤其是在含碳量高的氧化帶種類較多，而礦石帶所含鐵細(xì)菌種類單一，可能是高濃度鈾對(duì)鐵細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用的結(jié)果，具體原因有待于進(jìn)一步探索.

2.1.3 硫桿菌

對(duì)各巖石樣品中的硫桿菌進(jìn)行分離、純化，共分離出兩種不同的硫桿菌，按照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表5.

由表5可以看出，在氧化帶存在少量排硫硫桿菌、氧化亞鐵硫桿菌，弱氧化帶僅有氧化亞鐵硫桿菌存在.

表5 硫桿菌的特征與分類

2.1.4 硝化菌

對(duì)各巖石樣品中的硝化細(xì)菌進(jìn)行分離、純化，結(jié)果僅在氧化帶巖石中分離出兩類硝化細(xì)菌，按照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 硝化菌的特征與分類

由表6可以看出，僅在氧化帶分離得到了硝化菌，它們分屬于兩個(gè)菌屬，說(shuō)明僅有氧化帶環(huán)境適合硝化菌的生長(zhǎng).

2.2 各類細(xì)菌的分布規(guī)律

為考察東勝砂巖型鈾礦床中細(xì)菌的分布規(guī)律，對(duì)不同巖石樣品中的各屬細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7.

表7 東勝砂巖型鈾礦樣品中微生物分布及數(shù)量 個(gè)/g

由表7可以看出，各亞帶巖石樣品中細(xì)菌的種類和數(shù)量有明顯的差異.

氧化帶細(xì)菌種類和數(shù)量最多，鐵細(xì)菌和硫酸鹽還原菌為優(yōu)勢(shì)菌群.由于該區(qū)域礦石碳元素供給充裕，所以鐵細(xì)菌和其他菌十分活躍，它們發(fā)育旺盛，繁殖較快，在圍巖內(nèi)部創(chuàng)造了適合各類微生物生長(zhǎng)繁殖的微環(huán)境，也為厭氧的硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)和代謝創(chuàng)造了條件[12].

弱氧化帶細(xì)菌的種類和數(shù)量相對(duì)較多，鐵細(xì)菌與硫酸鹽還原菌均存在，但相對(duì)而言，鐵細(xì)菌數(shù)量減少，硫酸鹽還原菌數(shù)量增多，硝化細(xì)菌未檢出.這應(yīng)與巖石樣品含碳量下降、含鈾量增加及其所處的地球化學(xué)區(qū)域環(huán)境相關(guān).

礦石帶主要的細(xì)菌類群為厭氧的含芽孢硫酸鹽還原菌，這是因?yàn)檫@個(gè)區(qū)域含鈾量高，含碳量較低，不利于普通細(xì)菌的生長(zhǎng)，也說(shuō)明芽孢對(duì)于抵抗不良環(huán)境具有很大的作用，是硫酸鹽還原菌可以廣泛分布的主要原因.

各巖石樣品中均分離得到了鐵細(xì)菌和含芽孢硫酸鹽還原菌，說(shuō)明它們是東勝鈾礦巖石中的優(yōu)勢(shì)菌群，是鈾礦形成中除了理化因素外的重要生物因素.

3 結(jié)論

(1) 東勝砂巖型鈾礦床容礦層巖石中細(xì)菌分布廣泛，種類多樣.

(2) 不同亞帶巖石中主要細(xì)菌類群的分布特征不同，呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域差異性.

(3) 硫酸鹽還原菌和鐵細(xì)菌是整個(gè)礦床中的優(yōu)勢(shì)菌群，具有芽孢的脫硫腸狀菌分布最為廣泛，在各亞帶均有分布；硫桿菌和硝化菌在各亞帶分布不均.這些變化規(guī)律與各亞帶的地質(zhì)環(huán)境、碳含量、鈾品位有關(guān).

(4)不同種屬的硫酸鹽還原菌對(duì)成礦的貢獻(xiàn)有待于采用模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證.