基于代謝組學(xué)分析兩種產(chǎn)地青花椒中非揮發(fā)性成分的差異

楊青青，王智榮，彭林，陳巧莉，聞樂嫣，郭澤航，闞建全*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 3(中匈食品科學(xué)合作研究中心，重慶，400715)

花椒具有獨特的香味和口感，在中國烹飪和食品加工業(yè)中被廣泛用于辛辣調(diào)味。青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.)這一品種氣味清香，且麻味濃厚，相比于紅花椒更受消費者的喜愛[1]。青花椒中主要有揮發(fā)油、氨基酸、香豆素、酰胺類化合物等化學(xué)成分，具有較高的營養(yǎng)價值及功能價值[2]?；ń分谢瘜W(xué)成分的含量和組成很大程度上取決于花椒自身品種和產(chǎn)地環(huán)境[3-4]。青花椒主產(chǎn)于重慶江津和四川金陽兩地，這2種青花椒在市場上廣受歡迎。但由于兩地的地理、氣候條件有所不同，可能會導(dǎo)致青花椒中化學(xué)成分的組成及含量存在差異，進而影響其風(fēng)味和功能價值。

目前，國內(nèi)外大量的研究均關(guān)注于青花椒的揮發(fā)油成分及其香氣特征，對于不同產(chǎn)地青花椒中的揮發(fā)油成分的研究已較為成熟[5-6]。除此之外，青花椒中的類黃酮、酰胺類、氨基酸等非揮發(fā)性物質(zhì)在其滋味、藥用價值上起著關(guān)鍵作用，同樣極具研究和開發(fā)價值。但目前對青花椒中非揮發(fā)性成分的研究通常存在多指標(biāo)檢測操作繁雜、測定結(jié)果籠統(tǒng)而不能體現(xiàn)其具體成分、缺乏深度等缺點。近年來興起的代謝組學(xué)技術(shù)為解決這一問題提供了新思路，其中非靶向代謝組學(xué)可對一定生理狀態(tài)或特定條件下的樣本中所有代謝物進行綜合全面、無偏性的高覆蓋檢測，可尋找和鑒定出不同樣品的差異代謝物，從而實現(xiàn)代謝特征的比較[7]，為精確完整地分析不同產(chǎn)地的青花椒非揮發(fā)性成分提供了可行性。

因此，本研究采用基于超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbital trap high resolution mass spectrometry，UPLC-QE-Orbitrap-MS)的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對金陽和江津兩產(chǎn)地青花椒中非揮發(fā)性成分進行全面的鑒定，同時結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析方法對2種青花椒進行區(qū)分，并篩選得到化學(xué)標(biāo)記物，以期為青花椒精深加工提供理論基礎(chǔ)，為今后青花椒的優(yōu)良種質(zhì)資源篩選、栽培管理等方面提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒，分別采自重慶江津和四川金陽。甲醇、乙腈、醋酸銨、氨水(均為色譜級)，上海安譜實驗科技股份有限公司；L-2-氯苯丙氨酸(純度≥98%)，上海恒柏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜，美國賽默飛世爾科技；JXFSTPRP-24研磨儀，上海凈信科技有限公司；VORTEX-5渦旋儀，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

2種青花椒各設(shè)置6個生物組重復(fù)。將青花椒用粉碎機粉碎后過40目篩，備用。

1.3.2 代謝物的提取

青花椒中代謝物的提取方法基于相關(guān)文獻方法[8]略做修改。稱取50 mg青花椒粉末加入至2 mL離心管中，加入1 000 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]后渦旋30 s將其混勻；隨后于研磨儀中45 Hz處理4 min，在冰水浴中超聲5 min，重復(fù)上述研磨和超聲步驟3次；將得到的溶液靜置在-20 ℃中1 h。靜置后，4 ℃下13 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，準(zhǔn)備上機檢測。

質(zhì)控(quality control，QC)樣本是通過將以上所有待測樣本等量混合而制得，在液質(zhì)檢測的過程中，每6～10個檢測分析樣本中插入一個QC樣本，與分析樣本的采用相同的檢測方法。QC樣本用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。通過對不同QC樣本的基峰離子流圖(basic peak ion current diagram，BPC)進行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性以及儀器的穩(wěn)定性。對所有樣本和QC樣本進行PCA分析，通過觀察QC樣本間的離散度，可以得知儀器分析的穩(wěn)定性和可靠性。

1.3.3 UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測條件

UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測參考相關(guān)文獻并做一定的修改[9]。使用Agilent 1290超高效液相色譜儀以及Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)液相色譜柱。正離子模式(positive ion mode，PIM)下流動相A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，流動相B相為乙腈，采用梯度洗脫：0～1.0 min，1% B；1.0～8.0 min,1%～99% B；8.0～10.0 min，99% B；10.0～10.1 min，99%～1% B；10.1～12 min，1% B。；負(fù)離子模式(negative ion mode，NIM)下流動相A相為5 mmol/L醋酸銨水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值至9.0)，流動相B相為乙腈；梯度洗脫條件同正離子模式；進樣體積為1 μL，流速為0.5 mL/min。

Thermo Q Exactive質(zhì)譜儀在控制軟件(Xcalibur，版本：4.0.27，Thermo)控制下進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。MS參數(shù)條件為：電噴霧(electrospray Ionization，ESI)離子源；噴霧電壓為3 800 V(PIM)或-3 100 V(負(fù)離子模式)；毛細(xì)管溫度為320 ℃，鞘氣流速為45 Arb；輔助氣流速為15 Arb；質(zhì)量掃描范圍為70～1 000m/z，一級分辨率為70 000，二級分辨率為17 500；分步碰撞能量的強度取值為3；分步碰撞能量依次為20、40和60 eV，掃描速率為7 Hz。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

首先，使用ProteoWizard軟件將經(jīng)質(zhì)譜分析后的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzML格式；然后使用ChromaTOF軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[10]。采用Compound Discover(2.0版，Thermo)和OSI-SMMS(1.0版，大連化學(xué)數(shù)據(jù)解決方案信息技術(shù)公司)，與MassBank、HMDB、MoTo DB、METLIN及Mzcloud數(shù)據(jù)庫等進行物質(zhì)鑒定，再將質(zhì)控樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。使用SIMCA 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA等多元統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種青花椒中非揮發(fā)性代謝物信息的多元統(tǒng)計分析

2.1.1 PCA分析

PIM和NIM下2種青花椒樣本的BPC圖如圖1所示。所有樣品的儀器分析信號強、各個色譜峰分離效果較好。此外，檢測中插入的QC樣本的BPC圖可以很好地重疊，說明儀器具有較好的穩(wěn)定性，樣品處理以及檢測的重復(fù)性高，為后續(xù)青花椒代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供可行性。

2種青花椒非揮發(fā)性代謝物的PCA圖如圖2所示。2種模式下，PC1和PC2均已包含樣品中大部分的代謝物信息，可用于后續(xù)分析。同時，2組青花椒樣品以及QC樣本組的平行樣本均各自聚集在一起，因此組間具有較好的重復(fù)性，數(shù)據(jù)可信度較高。此外，2種青花椒在圖中都有著明顯的分離趨勢，能夠從總體上反應(yīng)出2組樣品之間的代謝物差異。

2.1.2 OPLS-DA分析

PCA分析對相關(guān)性較小的變量不敏感，而OPLS-DA是一種監(jiān)督模型，能以最大程度地分離樣品更有利于尋找差異代謝物。如圖3所示，各組樣本的重復(fù)點相距較近，且分別聚成一類，表明數(shù)據(jù)重復(fù)性好；同時，2個樣品各居一側(cè)，區(qū)分效果非常明顯。此外，NIM模式下R2Y = 0.997，Q2Y = 0.912，PIM模式下R2Y = 0.994，Q2Y = 0.970，表示該模型的解釋度和預(yù)測度良好。為避免出現(xiàn)過擬合的情況，采用了置換檢驗法對OPLS-DA在無差異情況下的建模效果進行了考察(圖3)。2種模式下R2Y′和Q2′均小于原始模型的R2Y和Q2，則說明模型有意義，不存在過擬合現(xiàn)象，都符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況，具有良好的預(yù)測能力。后續(xù)可根據(jù)計算得出的變量重要性投影(variable importance inproject，VIP)值分析篩選其差異代謝物，VIP>1表示該代謝物對OPLS-DA模型中樣品組的分離起了重要作用[11]，VIP值越大表示該物質(zhì)在區(qū)分兩樣本中的作用越關(guān)鍵。

a-PIM下的江津青花椒樣本；b-PIM下的金陽青花椒樣本；c-PIM下的QC樣本； d-NIM下的江津青花椒樣本；e-NIM下的金陽青花椒樣本；f-NIM下的QC樣本圖1 兩種模式下江津青花椒、金陽青花椒和質(zhì)控樣本的基峰離子流圖Fig.1 BPC chromatogram of Jiangjin Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc., Jinyang Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.and QC samples in two modes

a-正離子模式；b-負(fù)離子模式圖2 兩種離子模式下2組樣品及質(zhì)控的PCA結(jié)果Fig.2 PCA results of two groups of samples and quality control in two modes 注：Ck-金陽青花椒；Test-江津青花椒(下同)

a-正離子模式模型得分圖；b-正離子模式模型驗證圖； c-負(fù)離子模式模型得分圖；d-負(fù)離子模式模型驗證圖圖3 兩種離子模式下兩組樣品的OPLS-DA模型得分圖與模型驗證圖Fig.3 Scatter diagram of OPLS-DA model score and model verification of two groups in two modes

2.2 兩種青花椒中非揮發(fā)性代謝物的差異分析

2.2.1 非揮發(fā)性差異代謝物的篩選與分析

設(shè)定2種青花椒中非揮發(fā)性差異代謝物的初步篩選條件為P<0.05，VIP>1，經(jīng)篩選共得到74種主要的非揮發(fā)性差異代謝物(表1)。為簡單、直觀地表現(xiàn)出代謝物的變化情況，以及顯示2種青花椒之間的總體模式特征，對這74種差異代謝物繪制了聚類熱圖(圖4)。在所有非揮發(fā)性差異代謝物中，總體上氨基酸類物質(zhì)在江津青花椒中呈上調(diào)表達，糖類、有機酸類以及類黃酮大多在金陽青花椒中呈上調(diào)表達。造成2種青花椒中化學(xué)成分差異的因素可能與生長環(huán)境息息相關(guān)，例如氣候、土壤條件、海拔高度等。

圖4 兩種青花椒中差異代謝物熱圖Fig.4 The heat map of differential metabolite in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.

花椒中氨基酸的組成和含量是營養(yǎng)質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，同時在呈味上也起著重要作用。由表1可知，氨基酸類化合物在江津青花椒中總體呈上調(diào)表達。2個樣本中的氨基酸呈現(xiàn)差異可能與土質(zhì)有關(guān)，江津青花椒多栽植于山坡地，山地的土質(zhì)條件較好，營養(yǎng)豐富，更有利于青花椒中氨基酸的合成[12]。此外，重金屬元素同樣也能誘導(dǎo)植物體內(nèi)氨基酸的大量積累[13]。江津土壤中的硒含量非常豐富，但這種土壤中往往也會伴隨著重金屬元素的存在[14]。多項研究表明，相較于我國土壤中重金屬含量的背景值，江津表層土壤中會含有更多的重金屬元素，尤其是Cd元素[15-16]，因此江津青花椒在生長過程中可能會面對更多的重金屬脅迫。在此情況下，植物體內(nèi)會增強脯氨酸合成酶的活性，或者抑制脯氨酸的氧化來應(yīng)對重金屬脅迫[17]，因而在江津青花椒中脯氨酸會更多地積累。同樣地，有研究表明在江津青花椒中呈上調(diào)表達的組氨酸也在植物抵御重金屬脅迫上起著重要作用[18]。綜上，2種青花椒中的氨基酸類成分呈現(xiàn)較大差異有可能與土質(zhì)條件和重金屬脅迫有關(guān)。

除氨基酸外，糖類、有機酸類及多酚黃酮類均在金陽青花椒中呈上調(diào)表達，這可能與兩地的光照和濕度有著緊密聯(lián)系。首先，花椒中的糖類成分主要存在于花椒果皮中，具有一定的營養(yǎng)價值，不可忽視[19]。有研究表明植物中糖類含量的變化可能是由于環(huán)境脅迫引起的，例如糖含量會因水分脅迫而增加[20]，從而對滲透脅迫起到抵御作用。例如在干燥條件下，植物中的海藻糖會表現(xiàn)出極強的水合能力，可以取代生物分子表面的結(jié)合水，從而加強了蛋白質(zhì)和生物膜的穩(wěn)定性來抵御干旱脅迫[21]。同時，海藻糖中的羥基與蛋白質(zhì)的極性基團和膜的磷酸基團之間還可形成氫鍵，以此來維持細(xì)胞膜在極端條件下的穩(wěn)態(tài)[22]。此外，如蔗糖、葡萄糖這種常見的可溶性糖在應(yīng)對水分脅迫時也起到了關(guān)鍵作用，其可以增大細(xì)胞的溶質(zhì)濃度，改善細(xì)胞的吸水能力[23]。金陽干燥的氣候可能會使青花椒更易受到水分脅迫，從而導(dǎo)致會糖類成分的大量積累。

同樣地，有機酸是一種代謝活性溶質(zhì)，在植物體內(nèi)參與滲透壓的調(diào)節(jié)和陽離子的平衡，因此水分脅迫也會促進有機酸的合成[24]。除了植物中常見的蘋果酸、莽草酸外，脫落酸的積累也在抗旱性中起著關(guān)鍵作用，它可以通過減少植物的蒸騰作用、穩(wěn)定生物膜以及改變植物體內(nèi)代謝來達到抗旱的目的[25]。同時，有機酸作為一種光合作用的中間體[26]，金陽長時間的日照便會導(dǎo)致有機酸在青花椒中的高度積累。

此外，由表1可得青花椒中的多酚黃酮類物質(zhì)豐富，且大部分是在金陽青花椒中呈上調(diào)表達。多酚黃酮類化合物屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，大多數(shù)通常是由于植物應(yīng)對生物和非生物脅迫而合成的。有研究表明水分脅迫會誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生氧化脅迫，例如蘆丁、槲皮苷、橙皮素等黃酮類化合物都具有較強的抗氧化活性，因而大量積累后可增強植物的氧化應(yīng)激，從而增加其抗旱性能[27-28]。同時，由于金陽紫外線強度高，在高光照強度下編碼多酚黃酮類化合物生物合成的結(jié)構(gòu)基因的表達和某些重要酶的活性會增加，因此多酚黃酮類化合物的含量也會隨之增加[29]。

表1 兩種青花椒中的非揮發(fā)性差異代謝物Table 1 Differential metabolites in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.

花椒果實中含量較高的肌苷、鳥苷在金陽青花椒中也呈現(xiàn)上調(diào)表達，這些物質(zhì)具有增強免疫、延緩衰老等重要的生理活性[30]。鳥苷和肌苷的合成受激酶或核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化，該途徑的激活和調(diào)節(jié)同樣也會受到水分脅迫的影響[31]。總的來說，江津雨量充沛，濕潤多陰，而金陽日照時間長，紫外強度高，空氣干燥，兩地的氣候原因可能導(dǎo)致了2種青花椒中糖類成分、有機酸、多酚類黃酮等成分呈現(xiàn)出較大的差異。

2.2.2 化學(xué)標(biāo)記物的篩選

為尋找植物中的內(nèi)源性化學(xué)標(biāo)記物，經(jīng)大量的研究目前已形成了系統(tǒng)的代謝組學(xué)策略，通過PCA和OPLS-DA來進行篩選和驗證[32]，已成功應(yīng)用于對不同地理來源的苦艾草[33]、芹菜[34]、甘藍(lán)[35]等的差異研究。為進一步確定引起2種青花椒差異的關(guān)鍵物質(zhì)，參考基于代謝組學(xué)方法區(qū)分2種地理來源的生姜的研究[36]，從2種青花椒的74種非揮發(fā)性差異代謝物中，根據(jù)VIP>2、2組間的倍數(shù)變化差異(fold change，F(xiàn)C)>3和P<0.001(獨立樣本T檢驗)的條件繼續(xù)篩選出了9種具有極顯著差異的化合物，作為區(qū)分江津青花椒和金陽青花椒的特征性化學(xué)標(biāo)記物，分別是羥基-α-山椒素、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、奎尼酸、莽草酸、2-異丙基蘋果酸、L-精氨酸、L-賴氨酸。為了更直觀地了解化學(xué)標(biāo)記物，使用箱形圖比較來自2個產(chǎn)地的青花椒樣品中這9種物質(zhì)的含量豐度差異(圖5)。特征性標(biāo)記物的鑒定為今后開發(fā)快速、針對性和低成本的診斷性生物標(biāo)記物分析方法奠定了理論基礎(chǔ)，可應(yīng)用于青花椒的育種或質(zhì)量評估分析。

圖5 兩種青花椒中9種化學(xué)標(biāo)記物的相對含量豐度Fig.5 Relative peak intensities of.nine chemical markers in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.

3 結(jié)論

采用基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對2種青花椒的非揮發(fā)性成分進行鑒定分析，無監(jiān)督的PCA分析以及OPLS-DA模型分析實現(xiàn)了對2種產(chǎn)地青花椒的明顯區(qū)分，說明代謝組技術(shù)可作為一種區(qū)分金陽青花椒和江津青花椒的有效手段。

2種青花椒中存在74種差異代謝物，包括有生物堿類、有機酸類、糖類、多酚黃酮類、酰胺類、香豆素類、氨基酸類等成分。從總體上看，氨基酸類成分在江津青花椒中呈上調(diào)表達，而有機酸類、糖類、多酚黃酮類等在金陽青花椒中呈上調(diào)表達，同時提出了2種青花椒中非揮發(fā)性成分差異的可能發(fā)生機制。此外，經(jīng)進一步篩選確認(rèn)了2個產(chǎn)地青花椒中具有極顯著差異的物質(zhì)，分別是羥基-α-山椒素、蔗糖、海藻糖、棉子糖、奎尼酸、莽草酸、2-異丙基蘋果酸、L-精氨酸、L-賴氨酸，可作為區(qū)分這2種青花椒的特征性化學(xué)標(biāo)記物。

綜上，本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)可以對青花椒中非揮發(fā)性成分進行全覆蓋、無偏性的分析，從而能成功地對2種產(chǎn)地的青花椒進行區(qū)分，為今后青花椒的精深加工以及育種提供了參考方向。