重組人干擾素α-2b溶液型鼻腔給藥制劑穩(wěn)定性初探研究

胡樂非，董明明，林 霞

0 引言

干擾素 α-2b 屬于I型干擾素，臨床應(yīng)用于抗病毒、抗腫瘤及治療急慢性病毒性肝炎，在新冠肺炎治療中得到了廣泛應(yīng)用，它由165～166個氨基酸組成，其分子量約為19kD[1]。干擾素可與靶細胞表面受體相結(jié)合，刺激細胞內(nèi)多種效應(yīng)蛋白質(zhì)分子合成，包括阻止細胞核糖體翻譯的病毒蛋白；弱化轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白，從而抑制mRNA的形成，同時還可以形成病毒核酸對應(yīng)的核酸酶，從而降解病毒核酸[2-3]。

目前霧化吸入注射用干擾素 α-2b已被新冠肺炎診療方案推薦用于一般治療。但霧化吸入療法需要特殊裝置，不利于疾病的預(yù)防及早期治療。干擾素 α-2b鼻腔給藥制劑，經(jīng)鼻黏膜給藥，可在局部直接發(fā)揮抗病毒作用。此外，鼻腔部位存在豐富的毛細血管和淋巴管，鼻腔上皮與血管壁緊密相連，上皮細胞間間隙較大，具有較高的滲透性，且鼻腔部位蛋白酶含量較低，也可吸收入血，通過其他途徑發(fā)揮抗病毒作用[4]。給藥無需醫(yī)院的霧化吸入給藥裝置，有效避免特殊時期交叉感染，患者順應(yīng)性好。

由于干擾素α-2b為蛋白類藥物，其水溶液穩(wěn)定性較差。因此，本文系統(tǒng)考察了緩沖體系pH、緩沖體系磷酸鹽的濃度、穩(wěn)定劑的種類及濃度、組合穩(wěn)定劑對干擾素α-2b穩(wěn)定性的影響，旨在開發(fā)一種穩(wěn)定的干擾素α-2b溶液型鼻腔給藥制劑。

1 儀器與試藥

重組人干擾素α-2b干擾素原液(上海華新生物高技術(shù)有限公司，批號：B202005025，純度99.9%，生物學(xué)活性2.1×108IU/ml，蛋白濃度1.1 mg/ml)；磷酸二氫鈉(二水)、無水磷酸氫二鈉、氯化鈉、賴氨酸、組氨酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；吐溫80(南京威爾有限公司)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，蒸餾水。

分析天平 BSA124S(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司)；離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司)；pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；冰箱(青島海爾科技有限公司)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外分析方法

2.1.1 色譜條件 參照《中國藥典》2020版測定蛋白含量，色譜柱以適合分離分子質(zhì)量為5～60 kD蛋白質(zhì)的色譜用凝膠為填充劑。色譜柱：TSK gel G200SWXL(7.8 mm×30 cm，5 μm)；流動相為：0.1 mol/L磷酸鹽-0.1 mol/L氯化鈉緩沖液，pH 7.0；流速：1 ml/min；進樣體積：50 μl；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃。

2.1.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取1 ml干擾素原液置于容量瓶中，流動相稀釋定容至 5、10、25、50、100 ml，分別得到蛋白濃度為220、110、44、22、11 μg/ml的干擾素標準溶液。離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，進樣，于“2.1.1”項下測定峰面積。濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，R2=0.999 5滿足測試要求。

2.1.3 精密度試驗 取 “2.1.2”項下濃度為11 μg/ml的干擾素標準溶液適量，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，取上清液，于“2.1.1”項下連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果峰面積RSD=0.44%，小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性考察 取“2.1.2”項下濃度為44 μg/ml的干擾素標準溶液適量，室溫下放置，在 0、4、8、12、24 h，取樣離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，于“2.1.1”項下進樣，考察主峰面積的變化。結(jié)果顯示，室溫放置樣品的峰面積RSD值為 0.92%，小于2.0%，穩(wěn)定性較好。

2.1.5 濾膜吸附性考察 取“2.1.2”項下濃度為44 μg/ml的干擾素標準溶液適量，用 0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾，每次過濾1 ml，取濾液作為供試品，直至過濾樣品峰面積不再發(fā)生變化，同時以離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)的溶液作為對照，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，考察主峰峰面積的變化情況。結(jié)果顯示，分別過濾棄去1、2、3 ml初濾液后，峰面積并無明顯變化，RSD值為0.31%，說明濾膜對樣品溶液的吸附作用可忽略不計，無需棄去初濾液。

2.2 磷酸鹽緩沖體系pH的篩選 由于鼻腔給藥制劑pH過高或過低，可能引起鼻黏膜刺激，因此，需將干擾素α-2b溶液pH值調(diào)節(jié)至與生理環(huán)境接近的pH范圍。而pH值亦可顯著影響干擾素α-2b的穩(wěn)定性。因此，本文考察了pH值5.0～7.5范圍內(nèi)干擾素α-2b溶液的穩(wěn)定性。

采用不同比例的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的溶液，配制pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5且濃度為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖體系。以干擾素α-2b蛋白總濃度的變化篩選磷酸鹽緩沖液的pH值。精密量取1 ml干擾素原液與9 ml不同pH值磷酸鹽緩沖液置于10 ml的EP管中，在37 ℃的水浴條件下考察穩(wěn)定性，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度作為對比，分別于0、2、4、6、8、12、24 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)進樣分析，結(jié)果見圖1。

圖1 不同pH緩沖液下干擾素α-2b蛋白相對百分含量結(jié)果

圖1顯示，當(dāng)pH值為5.5、7.0、7.5時，干擾素穩(wěn)定性較高，24 h后干擾素α-2b的相對百分含量分別為0 h的87.1%、89.9%、92.1%。其中pH為7.0和7.5時優(yōu)于pH 5.5。而當(dāng)pH為5.0、6.0和6.5時，干擾素的穩(wěn)定性較差。α-2b干擾素在近中性(pH 7.0)環(huán)境中穩(wěn)定性較高，酸性和堿性條件活性易降低，此外，本研究顯示，與pH為5.0、6.0和6.5時相比，pH 5.5環(huán)境下，蛋白濃度下降較為緩慢。可能是由于干擾素等電點為4.0～6.7，在此pH范圍內(nèi)，干擾素凈電荷為0，易聚集沉淀，導(dǎo)致蛋白濃度下降。在此pH范圍內(nèi)，由于離子環(huán)境微小差異，其聚集程度也有所區(qū)別。pH 5.5時，干擾素聚集速率略低于其他相近pH，從而導(dǎo)致蛋白濃度下降較為緩慢。

基于上述結(jié)果，當(dāng)pH為7.0時為中性，對鼻腔的刺激性較弱，初步選擇pH為7.0的磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系。

2.3 磷酸鹽緩沖液濃度的考察 分別配制濃度為5、10、20、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，精密量取1 ml干擾素α-2b原液與9 ml不同濃度的磷酸鹽緩沖液于10 ml的EP管中，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度作為對比，考察37 ℃的穩(wěn)定性。分別于0、4、6、8、12、24、48、72、144 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)進樣，HPLC分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度磷酸鹽緩沖液中干擾素α-2b蛋白含量結(jié)果

圖2顯示，當(dāng)磷酸鹽緩沖液的濃度為10 mmol/L時，24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，因此，確定磷酸鹽緩沖液的濃度為10 mmol/L。

2.4 不同穩(wěn)定劑的考察 蛋白制劑中多含有一定濃度穩(wěn)定劑，以提高穩(wěn)定性[5-7]。氨基酸對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有一定的支撐作用，同時氨基酸可以作為抗氧化增效劑，如：組氨酸、賴氨酸等均具有較強的抗氧化作用。EDTA二鈉是一種重要的螯合劑，可以螯合溶液中的金屬離子，防止金屬離子引起制劑變色、變質(zhì)、變濁等氧化降解。聚山梨酯80為親水型非離子表面活性劑，常用做助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，也具有一定的穩(wěn)定作用。

本文分別考察濃度為1 mg/ml的聚山梨酯80、EDTA二鈉、賴氨酸、組氨酸，以及賴氨酸與EDTA二鈉的組合作為穩(wěn)定劑，同時以不含穩(wěn)定劑的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)藥物溶液為對照(即空白組)，優(yōu)化穩(wěn)定劑種類。

精密量取1 ml干擾素原液與9 ml含有不同穩(wěn)定劑的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)于10 ml的EP管中，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度為對比，考察不同溶液在37 ℃條件下的穩(wěn)定性。分別于0、4、8、12、24、48、72、144 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，HPLC分析，結(jié)果見圖3。

圖3 不同穩(wěn)定劑溶液體系中干擾素α-2b蛋白含量結(jié)果

圖3顯示，與不含穩(wěn)定劑的干擾素α-2b溶液相比，分別以1.0 mg/ml EDTA二鈉、賴氨酸和組氨酸為穩(wěn)定劑時，干擾素α-2b溶液穩(wěn)定性顯著提高。1.0 mg/ml EDTA二鈉穩(wěn)定作用顯著優(yōu)于其他穩(wěn)定劑，37 ℃水浴孵育6 d時，干擾素α-2b蛋白相對百分含量仍高達89.6%。

進一步考察組合穩(wěn)定劑對干擾素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，與單獨加入EDTA二鈉或賴氨酸相比，加入組合穩(wěn)定劑(賴氨酸+EDTA二鈉)，干擾素α-2b穩(wěn)定性降低，這可能是由于賴氨酸降低了EDTA二鈉的絡(luò)合作用。

基于上述研究結(jié)果，確定穩(wěn)定劑為EDTA二鈉。

2.5 穩(wěn)定劑濃度的考察 以EDTA二鈉為穩(wěn)定劑，pH值為7.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液為溶劑，優(yōu)化穩(wěn)定劑濃度。分別考察濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml的EDTA二鈉對干擾素α-2b穩(wěn)定性的影響。

精密量取1 ml干擾素原液與9 ml含有不同濃度EDTA二鈉的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)于10 ml的EP管中，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度為對比，考察不同溶液在37 ℃條件下的穩(wěn)定性。分別于0、4、8、12、24、48、72、144 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，HPLC分析，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度EDTA二鈉溶液中干擾素α-2b蛋白含量結(jié)果

結(jié)果顯示，隨著EDTA二鈉濃度的降低，干擾素α-2b穩(wěn)定性逐漸降低，EDTA二鈉濃度為1.0 mg/ml時，穩(wěn)定性顯著優(yōu)于其他濃度。因此，確定EDTA二鈉濃度為1 mg/ml。

基于上述研究結(jié)果，確定干擾素α-2b溶液的組成為：10%(w/w)干擾素原液，1 mg/ml EDTA二鈉、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)。溶液中干擾素α-2b蛋白濃度為0.11 mg/ml，生物學(xué)活性為2.1×107IU/ml。該溶液可在37 ℃穩(wěn)定6 d。

3 討論

當(dāng)前新冠肺炎疫情在全球范圍肆虐，干擾素α-2b不僅作為此次新冠病毒感染的治療方案推薦，也是作為兒童抗病毒治療推薦藥物。但是干擾素作為蛋白類藥物，其穩(wěn)定性較差且貯存條件較為苛刻，在此背景下開發(fā)一種處方簡單、穩(wěn)定性較好、使用方便、適用于新冠疫情期間普通人群和隔離人群的預(yù)防以及早期感染者治療的干擾素制劑十分必要。

本研究系統(tǒng)考察了磷酸鹽緩沖體系pH值、緩沖體系磷酸鹽的濃度、穩(wěn)定劑種類、穩(wěn)定劑濃度對干擾素α-2b蛋白穩(wěn)定性的影響，對干擾素α-2b干擾素溶液型鼻用制劑的處方進行了初步探索，確定磷酸鹽緩沖體系的濃度為10 mmol/L，且pH為7.0；篩選了4種常用穩(wěn)定劑，EDTA二鈉穩(wěn)定作用明顯優(yōu)于其他3種穩(wěn)定劑；EDTA二鈉濃度為1 mg/ml。后續(xù)將繼續(xù)考察干擾素α-2b在該溶液體系中的長期穩(wěn)定性，為α-2b干擾溶液型鼻用制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。