氫嗎啡酮預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷時PI3K/Akt的影響

張 郃，龍 超，楊 麗，張森兵，董文理

0 引言

腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是腎移植及心血管大手術(shù)后常引發(fā)的急性腎損傷的病理生理過程。經(jīng)典的麻醉藥物嗎啡可在大鼠腎缺血再灌注損傷的實驗中顯示出藥物預(yù)處理的保護作用[1]，氫嗎啡酮是嗎啡的半合成衍生物，鎮(zhèn)痛效應(yīng)是嗎啡的10倍，且不良反應(yīng)少，在前期研究發(fā)現(xiàn)，氫嗎啡酮預(yù)處理減輕大鼠心肌[2]、視網(wǎng)膜[3]的缺血再灌注損傷。有研究證實，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路在RIRI中起著非常重要的調(diào)控作用[4]。本研究擬建立大鼠腎缺血再灌注模型，觀察氫嗎啡酮預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷中PI3K/Akt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品和試劑 氫嗎啡酮注射液,宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；TNF-α、IL-6、MDA、SOD、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，武漢賽格爾生物科技有限公司生產(chǎn)；Bax、Bcl-2 單克隆抗體，美國 Cell Signaling Technology 公司生產(chǎn)；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體,上海信裕生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 動物分組、給藥方法及RIRI模型建立 健康雄性清潔級成年SD大鼠36只，體重180～220 g，于溫度23 ℃、濕度50%環(huán)境下飼養(yǎng)。實驗動物由湖北科技學(xué)院動物實驗中心提供，動物合格證號：SYXK(鄂)2018-0016。所有大鼠實驗前禁食12 h。SD大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IRI組)和氫嗎啡酮預(yù)處理組，每組12只。造模前25 min實驗組大鼠腹腔注射氫嗎啡酮30 μg/kg，其余兩組注射等量生理鹽水。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，三組大鼠背部腎區(qū)切口，鈍性分離肌肉組織和腎筋膜，分離雙側(cè)腎動脈，S組大鼠只分離雙側(cè)腎動脈但不夾閉，其余兩組夾閉雙側(cè)腎動脈至腎臟顏色變?yōu)樯n白，缺血45 min時松開動脈夾，恢復(fù)腎臟灌注至腎臟顏色變?yōu)轷r紅，制備缺血再灌注模型。于再灌注24 h后處死大鼠，取腎組織及血樣本。

1.3 HE染色法觀察各組IRI大鼠腎組織病理形態(tài) 各組隨機取4只大鼠左腎上極組織，10%福爾馬林固定24 h，隨后依次進行酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。選取包含左腎上極組織的縱切面切片，切片厚度為5 μm，行常規(guī)HE染色。每組取5張切片進行觀察，光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機取5個視野(400×)進行觀察并拍照。

1.4 ELISA法檢測血BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD水平 各組隨機取4只大鼠血清2 ml，室溫靜置20 min，6 000 r/min離心5 min，取上清。參照ELISA試劑盒說明，全自動生化分析儀測定血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量。

1.5 Western blot法測定腎組織Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達 各組隨機取4只大鼠腎組織裂解提取蛋白，測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離目的蛋白。冰浴轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉1～2 h。加入Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt抗體，4 ℃孵育過夜。二抗孵育1 h后TBST清洗，顯色曝光，掃描 膠片，BandScan軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)改變 S組腎小管、基底膜及刷狀緣結(jié)構(gòu)完整，清晰可見；IRI組腎小管腫脹明顯，基底膜及刷狀緣缺失或脫落，可見空泡狀壞死，腎間質(zhì)水腫明顯，并可見大量中性粒細胞浸潤；與IRI組相比，H組腎小管、基底膜及刷狀緣結(jié)構(gòu)相對完整，空泡狀壞死減少，腎間質(zhì)水腫不明顯，僅見少量中性粒細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色典型照片(400×)

2.2 各組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量 與S組比較，IRI組和H組BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA含量均明顯升高，SOD含量均明顯降低(P<0.05)；與IRI組比較，H組BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA含量均明顯降低，SOD含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量

2.3 各組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較 與S組比較，IRI組及H組 Bax、p-PI3K、p-Akt相對表達量均明顯升高，Bcl-2明顯降低(P<0.05)；與IRI組比較，H組Bcl-2、p-PI3K、p-Akt相對表達量均明顯升高，Bax明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 大鼠腎組織Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，吸入類[5]、右美托咪定[6]等麻醉藥物可在大鼠腎缺血再灌注損傷的實驗中顯現(xiàn)出預(yù)處理后的保護作用。既往的基礎(chǔ)研究表明，阿片受體激動劑預(yù)處理在腎缺血再灌注損傷模型中的保護作用機制多與激活了阿片受體有關(guān)，主要通過啟動減弱炎癥級聯(lián)反應(yīng)、減少氧自由基生成、抗凋亡挽救激酶信號途徑等方式得以實施[1,7]。

氫嗎啡酮是一種強效的阿片類鎮(zhèn)痛藥，在RIRI模型中是否具有類似效應(yīng)，還需進一步證實。本研究發(fā)現(xiàn)，氫嗎啡酮預(yù)處理后，RIRI模型大鼠腎小管無明顯腫脹，間質(zhì)水腫較少，刷狀緣較整齊，空泡變性壞死輕微，提示氫嗎啡酮可減輕RIRI的腎組織病理損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，IRI組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、Bax升高，SOD、Bcl-2下降，其腎功能受損、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細胞凋亡程度均較S組加重，而采用氫嗎啡酮預(yù)處理后，上述癥狀和指標(biāo)均有明顯改善，說明氫嗎啡酮可在腎缺血再灌注損傷的過程中發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡的保護作用。

經(jīng)典PI3K/Akt信號通路的研究在RIRI模型中，其主要病理過程為外界刺激和(或)創(chuàng)傷促使PI3K的活化，加速其磷酸化轉(zhuǎn)化為PIP3，進而誘導(dǎo)Akt的磷酸化，而活化的 Akt可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細胞凋亡等過程[8]。有報道，嗎啡[9]、舒芬太尼[10]等阿片類藥物均可通過激活PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡因子的表達，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷時細胞凋亡，也有研究表明，氫嗎啡酮可通過調(diào)節(jié)Bax 及Bcl-2 表達抑制其凋亡，進而減輕其缺血再灌注損傷[11]。在腎缺血再灌注損傷模型的研究中，其他藥物或保護措施也可通過激活PI3K/Akt信號通路，減少小鼠RIRI的TNF-α、IL-6表達水平，減輕炎癥反應(yīng)[12-13]；也可抑制腎內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減少ROS的釋放，調(diào)節(jié)SOD、MDA的表達，提高細胞存活率[14]；并可抑制促凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase等的形成，抑制腎細胞凋亡[15]，達到減輕腎缺血再灌注損傷的目的。本研究顯示，IRI組及H組 p-PI3K、p-AKT含量均明顯升高，且H組p-PI3K、p-Akt明顯高于IRI組，說明氫嗎啡酮也可通過激活PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷的程度。

本研究中，IRI組及H組的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細胞凋亡水平均較S組增加，而采用氫嗎啡酮預(yù)處理后，上述變化得以緩解，但p-PI3K、p-AKT的表達則相對升高，推測氫嗎啡酮可通過激活PI3K/Akt信號通路，減輕腎缺血再灌注損傷過程中的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細胞凋亡。

綜上所述，氫嗎啡酮可通過PI3K/Akt 信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細胞凋亡水平，減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。