尼可地爾對(duì)野百合堿誘導(dǎo)PAH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

陳 靜，楊海燕，毛亞飛，占煥平，魏宇峰

0 引言

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是指肺動(dòng)脈壓力過高的一種病理生理狀態(tài)，常導(dǎo)致右心衰竭，既可是獨(dú)立的疾病或綜合征，也可是由其他疾病引起的并發(fā)癥[1-2]。平均肺動(dòng)脈壓(Mean pulmonary arterial pressure,mPAP)和右心室肥厚指數(shù)是反映PAH嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[3-4]。PAH的發(fā)病與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary arterial endothelial cells，PAECs)功能失調(diào)以及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增生有關(guān)，其細(xì)胞活動(dòng)與離子通道緊密相關(guān)。尼可地爾是首個(gè)應(yīng)用于臨床的鉀離子通道開放劑，其機(jī)制與鉀離子通道激活后，鉀離子流出后所引起的鈣離子內(nèi)流減少，導(dǎo)致血管平滑肌松弛和血管舒張有關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),尼可地爾對(duì)野百合堿(Monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的PAH小鼠的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[7]。本研究通過比較鉀離子通道開放劑尼可地爾以及鉀離子通道封閉劑5-羥基葵酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)，探究尼可地爾對(duì)MCT誘導(dǎo)PAH大鼠PAECs氧化損傷及PASMCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 PAH大鼠造模與給藥 40只10周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(280±20)g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2008-0016，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表將40只SD大鼠分為4組，每組10只：對(duì)照組、MCT組、尼可地爾組、5-HD組。除對(duì)照組外，三組均接受MCT誘導(dǎo)造模，造模根據(jù)江曉丹等[8]的MCT誘導(dǎo)PAH大鼠方法加以改良，MCT組、尼可地爾組和5-HD組大鼠均一次性腹腔注射MCT溶液(60 mg/kg)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。對(duì)照組和MCT組每日灌胃給予5 ml/kg生理鹽水；尼可地爾組每日灌胃給予7.5 mg/kg尼可地爾；5-HD組每日先灌胃給予5 mg/kg 5-HD，30 min后再灌胃給予7.5 mg/kg尼可地爾。給藥過程共3周，自由進(jìn)食飲水。

1.2 PAH大鼠體重、血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥厚指數(shù)檢測(cè) 給藥3周后，各組大鼠稱重并記錄體重。1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，將大鼠右側(cè)頸部皮膚切開，暴露出右側(cè)頸外靜脈。用絲線結(jié)扎頸外靜脈遠(yuǎn)端血管后，將充滿0.1%肝素、外徑0.9 mm的PE-50管插入并緩慢推進(jìn)，從頸外靜脈右心房、右心室至肺動(dòng)脈。導(dǎo)管連接至PT-200T壓力換能器(Nihon Kohden公司，日本)，觀察示波器波形判斷導(dǎo)管是否到達(dá)肺動(dòng)脈。經(jīng)載波放大器后，生理記錄儀計(jì)算mPAP，作為血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后，頸椎脫臼處死大鼠。取出大鼠心肺組織，生理鹽水沖洗后，剪去心房組織，用濾紙吸干后分別稱量右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)的重量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)=RV/(LV+S)以反映右心室重量的變化。

1.3 PAH大鼠PAECs和PASMCs分離與培養(yǎng) PAH大鼠PAECs和PASMCs均分離自PAH大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈組織。PAECs采用Dynabeads CD31 Positive Selection試劑盒(Invitrogen，美國)分離，并根據(jù)Endothelial Cells Growth Media試劑盒(Lonza，美國)指導(dǎo)條件下培養(yǎng)于EGM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。PASMCs根據(jù)Smooth Muscle Cells Growth Media試劑盒(Sciencell，美國)指導(dǎo)下培養(yǎng)于平滑肌細(xì)胞(SMCM)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。PAECs細(xì)胞鑒定采用顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察和Ⅷ因子免疫熒光染色檢測(cè)，PASMCs細(xì)胞鑒定采用顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察和α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。

顯微鏡觀察下PAECs細(xì)胞均呈鵝卵石樣排列，而PASMCs細(xì)胞呈長梭形放射狀生長，有重疊生長現(xiàn)象，形成“峰-谷”狀。Ⅷ因子免疫熒光檢測(cè)PAECs細(xì)胞胞漿中大量顆粒呈紅色熒光；α-SMA免疫熒光檢測(cè)PASMCs細(xì)胞胞漿內(nèi)大量平行絲狀紅色熒光。

1.4 PAH大鼠PAECs內(nèi)活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)檢測(cè) 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光檢測(cè)PAECs中ROS水平。PAECs(1×106/孔)接種于6孔板中，加入500 μl 10 μmol/L ROS熒光探針DCFH-DA。避光條件下37 ℃孵育30 min，孵育期間每隔3～5 min混勻1次。之后流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

Greiss法檢測(cè)NO水平。PAECs(1×106/孔)接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板中，待細(xì)胞融合至80%，裂解細(xì)胞，采用NO檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國)檢測(cè)NO水平，NaNO2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 PAH大鼠PAECs內(nèi)蛋白激酶C-ε(PKCε)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和NADPH氧化酶(NOX)檢測(cè) Western blot法檢測(cè)PAECs內(nèi)PKCε和eNOS水平。PAECs接種含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至80%，RIPA試劑(Boster，美國)裂解細(xì)胞。經(jīng)1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min后，棄去上清，超聲波破碎。1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min后，取10 μl樣品與上樣緩沖液按4∶1比例混勻，100 ℃加熱10 min。行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。經(jīng)TBST溶液封閉90 min后，加入一抗PKCε和eNOS抗體(1∶500稀釋)，4 ℃下過夜孵育。第2天加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000稀釋)，室溫下孵育1 h，利用ECL顯色。以GAPDH為內(nèi)參，Quantity One軟件分析條帶灰度值，PKCε和eNOS與GAPDH灰度值比值作為PKCε和eNOS相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAECs內(nèi)NOX活性 PAECs(5×104/孔)接種于96孔板中，每孔加入20 μl 0.1% NBT，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，1 500轉(zhuǎn)/min離心。每孔加入200 μl DMSO后，室溫震蕩20 min，測(cè)570 nm處吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAMSCs增殖能力 PAMSCs接種于96孔板，細(xì)胞濃度5×103個(gè)/孔，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，于0 h、12 h、24 h、48 h、72 h檢測(cè)，每次加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，490 nm處測(cè)定吸光值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠給藥后體重、血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥厚指數(shù)比較 MCT組和5-HD組體重均低于對(duì)照組，mPAP和RV/(LV+S)均高于對(duì)照組，而尼可地爾組體重均高于MCT組和5-HD組，mPAP和RV/(LV+S)均低于MCT組和5-HD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重、血流動(dòng)力學(xué)和RV/(LV+S)

2.2 各組大鼠給藥后PAECs內(nèi)ROS和NO比較 MCT組和5-HD組PAECs內(nèi)ROS水平均高于對(duì)照組，NO水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);尼可地爾組PAECs內(nèi)ROS水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);尼可地爾組PAECs內(nèi)ROS水平均低于MCT組和5-HD組，NO水平均高于MCT組和5-HD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠PAECs內(nèi)ROS和NO水平

2.3 各組大鼠給藥后PAECs內(nèi)PKCε、eNOS和NOX比較 MCT組和5-HD組PAECs內(nèi)PKCε相對(duì)表達(dá)水平和NOX活性均高于對(duì)照組，尼可地爾組PAECs內(nèi)PKCε相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，但尼可地爾組PAECs內(nèi)PKCε相對(duì)表達(dá)水平和NOX活性均低于MCT組和5-HD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、圖3。

圖3 各組大鼠PAECs內(nèi)NOX活性

MCT組、尼可地爾組和5-HD組PAECs內(nèi)eNOS相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組，但尼可地爾組PAECs內(nèi)eNOS相對(duì)表達(dá)水平高于MCT組和5-HD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠PAECs內(nèi)PKCε、eNOS相對(duì)表達(dá)水平

2.4 各組大鼠給藥后PASMCs增殖能力比較 培養(yǎng)48～72 h，MCT組和5-HD組PASMCs增殖能力均高于對(duì)照組和尼可地爾組，而72 h時(shí)，尼可地爾組PASMCs增殖能力高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠PASMCs細(xì)胞增殖能力比較

3 討論

PAH作為常見的心血管疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)展性的肺動(dòng)脈血壓升高，常用鈣離子通道阻斷劑、類前列腺素藥物、內(nèi)皮素阻斷劑和5型磷酸二酯酶抑制劑治療[9-11]。然而近年來，有研究報(bào)道，鉀離子通道也與PAH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。

本研究擬通過尼可地爾治療MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠，檢測(cè)PAH大鼠PAECs和PASMCs相關(guān)指標(biāo)，驗(yàn)證尼可地爾的治療功效并為尼可地爾治療PAH提供理論基礎(chǔ)。

PAH與體重、mPAP以及[RV/(LV+S)]等多種指標(biāo)的異常變化有關(guān)，其中mPAP是PAH的主要指標(biāo)，[RV/(LV+S)]則反映了PAH的進(jìn)展情況。通過對(duì)比體重、mPAP以及[RV/(LV+S)]可知，相比空白對(duì)照，MCT誘導(dǎo)的各組大鼠體重增量更少，而mPAP和[RV/(LV+S)]增加，說明MCT誘導(dǎo)PAH成功。

ROS是細(xì)胞氧化損傷的主要指標(biāo)，過多的ROS產(chǎn)生會(huì)引起心血管損傷[13]。NO合成是內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控平滑肌細(xì)胞從而引起血管擴(kuò)張的主要方式，NO合成不足會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞的功能性障礙，從而引起PAH等一些系列心血管疾病[14-15]。與空白對(duì)照相比，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PAECs具有更高的ROS水平和更低的NO水平，表明PAH的發(fā)生發(fā)展與ROS增加和NO減少有關(guān)。再根據(jù)尼可地爾和5-HD處理后大鼠PAECs的ROS和NO水平比較可知，尼可地爾通過鉀離子通道開放效應(yīng)對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PAECs的ROS水平有抑制作用，對(duì)NO水平有促進(jìn)效果。為了驗(yàn)證ROS和NO水平變化的機(jī)制，本研究檢測(cè)了ROS生成有關(guān)的酶PKCε的表達(dá)和NOX的活性以及與NO合成有關(guān)的酶eNOS的表達(dá)[16-18]。檢測(cè)結(jié)果表明，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PAECs的ROS水平及PKCε表達(dá)增加與NOX的活性升高有關(guān)，而NO水平的下降與eNOS表達(dá)下降有關(guān)。結(jié)果表明，尼可地爾治療引起PKCε的表達(dá)減少和NOX的活性降低，而eNOS表達(dá)增加，導(dǎo)致了ROS水平降低且NO水平升高。5-HD抑制了鉀離子通道開放后，PKCε、eNOS表達(dá)和NOX活性結(jié)果說明鉀離子通道開放效應(yīng)參與了PAECs內(nèi)PKCε、eNOS表達(dá)和NOX活性的調(diào)控。因此，尼可地爾通過鉀離子通道開放作用對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PAECs氧化損傷具有保護(hù)作用。

PASMCs的收縮和增殖與PAH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其過度收縮、增殖和凋亡比率失調(diào)均會(huì)影響到肺血管的重塑[19]。PASMCs的增殖速度越快，說明PAH的進(jìn)展程度越高[20]。MTT結(jié)果表明，空白對(duì)照和尼可地爾治療后的大鼠PASMCs的增殖能力低于只經(jīng)MCT誘導(dǎo)PAH大鼠PASMCs，說明尼可地爾可以抑制MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PASMCs增殖能力，而與5-HD處理后的PAH大鼠PASMCs增殖能力高于尼可地爾治療后，表明鉀離子通道的開放與否能夠影響MCT誘導(dǎo)PAH大鼠PASMCs增殖能力。

綜上所述，尼可地爾對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PAECs氧化損傷具有保護(hù)作用，可抑制PASMCs增殖，鉀離子通道開放可能是其作用機(jī)制。