CD4+效應(yīng)型記憶T細(xì)胞與白細(xì)胞介素-6聯(lián)合超敏C-反應(yīng)蛋白對急性缺血性卒中合并肺感染的診斷價(jià)值

黃小雨 李鳳展 劉壇 楊婷婷 付琳琳 張勇

急性缺血性卒中是臨床十分常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高病殘率、高死亡率之特點(diǎn)［1］。肺感染是其常見并發(fā)癥，可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、增加死亡風(fēng)險(xiǎn)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2-4］，因此早期預(yù)測指標(biāo)對急性缺血性卒中患者肺感染的預(yù)防與管理具有重要意義。CD4+效應(yīng)型記憶T細(xì)胞（CD4+TEM）是記憶T細(xì)胞（Tm）之亞群，在炎癥微環(huán)境刺激下CD4+TEM細(xì)胞表達(dá)升高，同時(shí)可迅速遷移至外周炎癥部位發(fā)揮效應(yīng)功能，為機(jī)體提供免疫記憶保護(hù)，有望成為臨床診斷炎癥性疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志物［5-7］。目前，國內(nèi)外關(guān)于CD4+TEM細(xì)胞診斷急性缺血性卒中肺感染的研究尚屬空白，尤其是在白細(xì)胞介素-6（IL-6）和超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）等炎性指標(biāo)單獨(dú)檢測對早期預(yù)測的敏感性與特異性仍有待提高的情況下，對CD4+TEM細(xì)胞的研究更是成為不可或缺的課題［8-9］?；诖?，筆者以徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科近年收治的109例急性缺血性卒中患者為觀察對象，以探究其外周血CD4+TEM細(xì)胞表達(dá)變化，并進(jìn)一步分析CD4+TEM與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測價(jià)值。

對象與方法

一、研究對象

1.診斷標(biāo)準(zhǔn) （1）急性缺血性卒中的診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》之標(biāo)準(zhǔn)［10］，且經(jīng)頭部CT和（或）MRI確診。（2）肺感染診斷依據(jù)2010年公布的《卒中相關(guān)性肺炎診治中國專家共識(shí)》標(biāo)準(zhǔn)［11］。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn) （1）患者發(fā)病時(shí)間＜48 h。（2）排除發(fā)病時(shí)間＞48 h；合并有免疫、血液、腫瘤、嚴(yán)重心肝腎疾患或生命體征不穩(wěn)定；近3個(gè)月內(nèi)發(fā)生過缺血性卒中、腦出血或罹患消化道、呼吸道、泌尿系、生殖道、皮膚感染等慢性感染性疾病。

3.一般資料 根據(jù)上述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇2018年6月至2019年12月于我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性缺血性卒中患者共109例，男性63例，女性46例；年齡38～93歲，平均（64.15±12.54）歲。既往有吸煙史者占26.61%（29/109）；合并高血壓者占48.62%（53/109）、糖尿病14.68%（16/109）、冠心病12.84%（14/109）；存在吞咽困難占17.43%（19/109）。美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分3～29，平均評分12.22±5.85。以是否合并肺感染為分組標(biāo)準(zhǔn)，分為肺感染組（感染組，54例）和無肺感染組（對照組，55例），兩組一般資料比較，感染組吸煙（P=0.045）、吞咽困難（P=0.021），以及NIHSS評分（P=0.000）等項(xiàng)指標(biāo)略高于對照組（表1）。

二、研究方法

1.評價(jià)指標(biāo) （1）流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+TEM細(xì)胞表型：所有患者均于入院第2天晨起空腹抽取外周靜脈血6 ml，其中2 ml以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，余4 ml進(jìn)行血清分離。采用人淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）通過密度梯度離心法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）懸液，磷酸鹽緩沖液洗滌，于離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速1500 r/min離心5 min，去上清液，磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌，再次離心5 min，去上清液，加入磷酸鹽緩沖液500μl重懸細(xì)胞，分別滴加鼠抗人CD3-APC-Cy7、CD4-APC、CD45RA-V450、CD45RO-PE-Cy7、CD62L-PE和CCR7-BV510抗體（美國BD公司），同時(shí)設(shè)同型對照管，室溫避光孵育15 min，LSRF ortessa型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測CD4+TEM細(xì)胞，檢測表型為CD3+CD4+CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-［12-14］。然后，利用流式設(shè)門法分序圈出外周血CD3+T、CD4+T、CD4+記憶T細(xì)胞和CD4+TEM細(xì)胞，最后獲得CD4+TEM細(xì)胞占CD4+記憶T細(xì)胞之百分率。（2）其他指標(biāo)：采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法檢測血清IL-6、免疫散射比濁法測定hs-CRP水平，采用7171A全自動(dòng)生化儀檢測血糖、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肝腎功能等項(xiàng)生化指標(biāo)。

2.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；急性缺血性卒中肺感染的危險(xiǎn)因素篩查，采用單因素和多因素前進(jìn)法Logistic回歸分析（α入=0.05，α出=0.06）；以受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析CD4+TEM細(xì)胞百分率，及其與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用對急性缺血性卒中肺感染的預(yù)測價(jià)值，采用MedCalc軟件比較各項(xiàng)影響因素的預(yù)測價(jià)值。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本組患者血清LDL-C水平1.02～6.77 mmol/L，中 位 值 為2.57（1.91，3.12）mmol/L；血 糖 為5.21～12.37 mmol/L，中位值2.57（1.91，3.12）mmol/L；尿素2.10～8.66 mmol/L，平均（5.15±1.33）mmol/L；肌酐40～89 mmol/L，平均（57.26±10.32）mmol/L；IL-6 3.20～25.30 pg/ml，中位值8.50（7.25，12.40）pg/ml；hs-CRP 2.10～39.40 mg/L，中 位 值16.30（8.35，22.15）mg/L。感染組血清IL-6（P=0.000）和hs-CRP（P=0.000）水平高于對照組，但血清LDL-C、血糖、尿素及肌酐水平兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

表1 感染組與對照組患者一般資料的比較Table 1. Comparison of the baseline data in patients between infection group and control group

流式細(xì)胞術(shù)顯示，感染組CD4+TEM細(xì)胞百分率高于對照組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000；表2，圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，感染組外周血CD4+T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞和CD4+TEM細(xì)胞數(shù)目均高于對照組Figur e 1 Flow cytometry showed peripheral blood CD4+T cells,CD4+memory T cells and CD4+TEM cells in infection group were significantly higner than control group.

表2 感染組與對照組CD4+TEM細(xì)胞百分率的比較（x±s，%）Table 2. Comparison of the percentage of CD4+TEM between infection group and control group(x±s,%)

單因素Logistic回歸分析顯示，吞咽困難（P=0.026）、NIHSS評分（P=0.000）增加，以及IL-6（P=0.000）、hs-CRP（P=0.000）和CD4+TEM細(xì)胞百分率升高（P=0.000）為急性缺血性卒中肺感染的危險(xiǎn)因素（表3，4）。將上述因素代入多因素Logistic回歸方程，結(jié)果顯示，CD4+TEM細(xì)胞百分率（OR=1.153，

表3 急性缺血性卒中肺感染影響因素的變量賦值表Table 3. Variable assignment of the influenting factors related to pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke

95%CI：1.069～1.244；P=0.000）、IL-6（OR=1.351，95%CI：1.046～1.747；P=0.021）和hs-CRP（OR=1.087，95%CI：1.008～1.172；P=0.021）水平升高是急性缺血性卒中肺感染的危險(xiǎn)因素（表5）。

表5 急性缺血性卒中肺感染影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5. Multivariate Logistic regression analysis of influenting factors of pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke

由ROC曲線分析可見，CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP曲線下面積分別為0.906（SE=0.028，95%CI：0.850～0.961；P=0.000）、0.799（SE=0.044，95%CI：0.714～0.885；P=0.000）、0.831（SE=0.039，95%CI：0.754～0.908；P=0.000）。當(dāng)CD4+TEM細(xì)胞百分率與IL-6和hs-CRP進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測時(shí)，曲線下面積增至0.943（SE=0.020，95%CI：0.904～0.982；P=0.000，圖2）。利用Med Calc軟件對CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6、hs-CRP單獨(dú)檢測，以及三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積進(jìn)行兩兩比較，CD4+TEM細(xì)胞百分率單獨(dú)預(yù)測效果明顯優(yōu)于IL-6，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028），而與hs-CRP之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.083）；三指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測效果明顯優(yōu)于IL-6和hs-CRP單獨(dú)應(yīng)用，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），但與CD4+TEM細(xì)胞百分率單獨(dú)應(yīng)用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084，表6）。

圖2 ROC曲線顯示，CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP單獨(dú)檢測，以及三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測急性缺血性卒中肺感 染 的 曲 線 下 面 積 分 別 為0.906（95%CI：0.850～0.961）、0.799（95%CI：0.714～0.885）、0.831（95%CI：0.754～0.908），以及0.943（95%CI：0.904～0.982）Figure 2 ROC curve showed the AUC of the percentage of CD4+TEM cells,IL-6,hs-CRP and the combined detection of three indexes in predicting pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke was 0.906(95%CI:0.850-0.961),0.799 (95%CI:0.714-0.885),0.831 (95%CI:0.754-0.908)and 0.943(95%CI:0.904-0.982).

討 論

大量研究業(yè)已證實(shí)，由外周循環(huán)免疫細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)是急性缺血性卒中并發(fā)肺感染的主要原因，CD4+T、CD8+T、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和自然殺傷細(xì)胞（NK）等免疫細(xì)胞均參與其中［9，15-16］。然而，單純根據(jù)上述免疫細(xì)胞的表達(dá)變化診斷急性缺血性卒中肺感染尚難以達(dá)到早診斷、早治療的要求，因此尋找新型生物學(xué)標(biāo)志物對提高療效、改善預(yù)后有著極其重要的意義。

記憶T細(xì)胞是機(jī)體免疫防御和抗原清除系統(tǒng)的重要組成部分，可以針對外來及異種抗原迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，一直是抗感染和疫苗研制領(lǐng)域頗受關(guān)注的T細(xì)胞亞群［17］。CD4+TEM細(xì)胞是記憶T細(xì)胞抵御病原的第一道防線，在感染早期能夠迅速遷移至感染部位發(fā)揮效應(yīng)功能，并可長期在外周血及組織中表達(dá)［5］。目前已在結(jié)核桿菌或病毒感染等炎癥性疾病患者的外周血中觀察到CD4+TEM表達(dá)水平升高，提示該項(xiàng)指標(biāo)有望成為臨床診斷感染性疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志物［18-19］。既往研究證實(shí)，急性缺血性卒中患者并發(fā)感染與其體內(nèi)免疫功能紊亂密切相關(guān)，其中參與細(xì)胞免疫應(yīng)答的核心成分CD4+T細(xì)胞在缺血性卒中患者外周血中的數(shù)目明顯減少，而并發(fā)肺感染者細(xì)胞免疫受抑制現(xiàn)象更為明顯，此與CD4+T細(xì)胞接受抗原刺激后發(fā)生克隆增殖和分化有關(guān)［15-16，20］。在接受抗原刺激后，初始T細(xì)胞發(fā)生特異性抗原提呈反應(yīng)，逐漸分化為記憶T細(xì)胞；后者具有較大的異質(zhì)性，根據(jù)是否表達(dá)CC族趨化因子受體7（CCR7）和白細(xì)胞分化抗原62L（CD62L）進(jìn)一步分為中央型記憶T細(xì)胞（TCM）和效應(yīng)型記憶T細(xì)胞（TEM）細(xì)胞，其中TEM細(xì)胞比初始T細(xì)胞和TCM細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗原識(shí)別能力和激活免疫反應(yīng)性，能夠迅速向炎癥部位趨化，發(fā)揮效應(yīng)功能［13，21］。因此，TEM細(xì)胞在一定程度上反映了機(jī)體之免疫狀態(tài)。本研究首次對急性缺血性卒中合并肺感染患者外周血CD4+TEM細(xì)胞百分率進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)感染組患者外周血CD4+TEM細(xì)胞表達(dá)明顯高于對照組，提示CD4+TEM細(xì)胞與急性缺血性卒中肺感染密切相關(guān)。

表4 急性缺血性卒中肺感染影響因素的單因素Logistic回歸分析Table 4. Univariate Logistic regression analysis of influenting factors of pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke

對本研究兩組患者一般情況的分析顯示，肺感染組吸煙者所占比例大、NIHSS評分高且大多合并有吞咽困難，而且血清IL-6和hs-CRP水平也明顯高于對照組。經(jīng)Logistic回歸分析，CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP水平升高為影響急性缺血性卒中肺感染的重要危險(xiǎn)因素，此與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致［8，22］。急性缺血性卒中患者在發(fā)病早期即可出現(xiàn)外周血IL-6水平升高，當(dāng)并發(fā)感染時(shí)，在應(yīng)激條件下IL-6等炎性因子的表達(dá)可進(jìn)一步升高，且隨著病情的進(jìn)展不斷上升。IL-6的升高可直接激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)hs-CRP等急性期炎性蛋白合成并擴(kuò)大炎癥細(xì)胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷［8，23］。與IL-6一致，hs-CRP也是機(jī)體炎癥狀態(tài)下的急性期反應(yīng)物，有研究顯示，急性缺血性卒中患者發(fā)病后其外周血hs-CRP即處于較高水平，并發(fā)感染后可使血清hs-CRP進(jìn)一步升高，且與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后呈正相關(guān)［24］?；诖?，我們進(jìn)一步繪制ROC曲線，分別對CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CD4+TEM細(xì)胞百分率曲線下面積大于IL-6，提示CD4+TEM細(xì)胞具有良好的診斷價(jià)值，而CD4+TEM與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用則具有更高的預(yù)測性，因此急性缺血性卒中發(fā)病早期行CD4+TEM細(xì)胞檢測，有利于早期干預(yù)，改善預(yù)后，尤其是與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測性更強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，與未合并肺感染的急性缺血性卒中患者相比，并發(fā)肺感染者外周血CD4+TEM細(xì)胞、IL-6和hs-CRP表達(dá)水平明顯升高，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用對急性缺血性卒中肺感染具有良好的預(yù)測性，有望成為新型生物學(xué)標(biāo)志物。

利益沖突 無