腦膠質(zhì)瘤中TERT啟動(dòng)子突變分析及預(yù)后研究

劉曉莉，屈玉玲，翟學(xué)鋒，楊治花

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展涉及多種不同的遺傳學(xué)改變[1-2]，其中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)主要通激活端粒酶的活性來維持端粒的完整性，使真核細(xì)胞獲得無限增殖能力，在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn),TERT啟動(dòng)子(TERTp)突變與各種腫瘤中mRNA表達(dá)獲端粒酶活性的增加有關(guān)。TERT在大腦膠質(zhì)瘤中存在較高表達(dá)率，主要?dú)w結(jié)于TERT啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)體細(xì)胞點(diǎn)的突變，即C228T和C250T 2個(gè)位點(diǎn)，總體突變率約為55%，導(dǎo)致TERTp的轉(zhuǎn)錄活性增加[3-4]。已有研究表明,TERTp突變可以作為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不良的獨(dú)立預(yù)后因子，亦可作為該類型較為特異的診斷標(biāo)志物。除此之外，在低級別膠質(zhì)瘤中，TERTp與染色體1p/19q聯(lián)合缺失密切相關(guān)[4]。本研究基于彌漫性膠質(zhì)瘤的組織病理特征，檢測不同級別及亞型膠質(zhì)瘤石蠟組織中TERTp突變情況，并結(jié)合隨訪資料探討TERTp狀態(tài)與不同亞型膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科2013年6月-2018年9月手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為彌漫性膠質(zhì)瘤(WHOⅡ-Ⅳ級)的石蠟標(biāo)本88例，臨床及病理資料情況見表1。

1.2 檢測方法

1.2.1 石蠟標(biāo)本提取基因組DNA:采用QIAGEN 公司DNA 提取試劑盒(69505)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行操作，并采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)檢提取DNA濃度(10 ng/μl≤濃度≤100 ng/μl)。

1.2.2 TERT啟動(dòng)子區(qū)突變檢測:①從樣本 DNA 液中取出 3 μl加至測序反應(yīng)液1中，予以42 ℃ 5 min、94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(進(jìn)行20個(gè)循環(huán))擴(kuò)增；② 取出 TERT 測序反應(yīng)液2,GC PCR MIX3，按照上述步驟及條件進(jìn)行10個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，再取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入 2 μl SAP混合物混勻,予以 37 ℃ 60 min、80 ℃ 15 min 進(jìn)行酶解；③取以上酶解產(chǎn)物3 μl、測序試劑 1μl和測序引物2 μl 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為96 ℃ 1 min,96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min(25次循環(huán)),恒溫4 min后將產(chǎn)物進(jìn)行提純;④將提純的產(chǎn)物置于基因分析儀上測序，使用測序分析軟件 Chroma 2.0分析數(shù)據(jù)。

1.3 隨訪:通過查閱病歷資料、電話咨詢、門診隨訪等方式，對所有患者進(jìn)行隨訪，記錄患者生存時(shí)間。隨訪截止日期2019年9月30日，隨訪時(shí)間0.9～97.3個(gè)月，平均28.4個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，用Fisher精確概率法判斷TERTp突變與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，用Kaplan-Meier法分析TERTp突變與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TERTp突變在彌漫性膠質(zhì)瘤發(fā)生情況:本組88例彌漫性膠質(zhì)瘤，TERT啟動(dòng)子C228T或C250T突變發(fā)生率為63.6%,其中WHOⅡ級占51.4%、Ⅲ級占65.0%、Ⅳ級占74.2%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細(xì)胞來源腫瘤(包括少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中有較高的突變率，分別為61.5%、66.7%和74.2%，見圖1(目錄后)。

2.2 TERT啟動(dòng)子突變與各臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性:在本組膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，TERTp突變(包括C228T和C250T)與患者的年齡(P<0.05)、腫瘤增殖指數(shù)呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，與彌漫性膠質(zhì)瘤IDH-1突變蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)也有相關(guān)性(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與患者的性別、膠質(zhì)瘤WHO分級之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 TERT啟動(dòng)子區(qū)突變與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 TERT啟動(dòng)子突變與患者生存時(shí)間相關(guān)性分析:88例膠質(zhì)瘤患者Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TERTp突變患者術(shù)后生存時(shí)間顯著低于野生型(P<0.05)。根據(jù)膠質(zhì)瘤起源，將膠質(zhì)瘤分成星形細(xì)胞起源的膠質(zhì)瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞起源的膠質(zhì)瘤單獨(dú)分析，發(fā)現(xiàn)TERTp突變在星形細(xì)胞源性腫瘤組中與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05)，而在少突膠質(zhì)細(xì)胞源性腫瘤組中與患者術(shù)后生存時(shí)間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。在老年組中(年齡≥45歲)，TERTp突變患者的生存時(shí)間與野生型患者生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

TERT是端粒酶其中的催化亞單位，當(dāng)TERT啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生微小遺傳學(xué)改變時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列發(fā)生改變，從而增強(qiáng)了TERT轉(zhuǎn)錄活性，避免了細(xì)胞衰老死亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。TERTp突變最先于黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)[5]，并證實(shí)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中突變頻率較高。本研究對88例彌漫性膠質(zhì)瘤進(jìn)行TERTp突變點(diǎn)檢測，檢測結(jié)果TERTp突變在膠質(zhì)瘤中總發(fā)生頻率為63.6%，在31例膠母中的發(fā)生頻率為74.2%，與Killela研究組報(bào)道的74.2%[6]和83.9%[7]基本一致。同時(shí)研究分析發(fā)現(xiàn)，TERTp突變在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中突變率較高，分別為61.5%和66.7%；而在星形細(xì)胞瘤中突變率僅36.4%。結(jié)合TERTp在膠質(zhì)瘤不同亞型的分布不難發(fā)現(xiàn),除外WHO Ⅳ的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞起源的膠質(zhì)瘤中TERTp突變的比例明顯高于星形細(xì)胞起源的膠質(zhì)瘤(包括彌漫性星形細(xì)胞瘤和間變型星形細(xì)胞瘤)。這一結(jié)果提示TERTp可作為彌漫性膠質(zhì)瘤分型的一個(gè)分子指標(biāo)。再分析其他臨床病理學(xué)指標(biāo)與TERTp突變的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在45歲及以上的人群組中，發(fā)生TERTp突變的膠質(zhì)瘤患者明顯多于未發(fā)生突變者(34∶8)，而在45歲以下的群體中無顯著差異性，歸因于本研究中原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者多為老年人，而TERT啟動(dòng)子突變主要集中在該亞型中。本研究還提示，TERTp突變與腫瘤增殖指數(shù)呈顯著正相關(guān)性，即增值指數(shù)而與彌漫性膠質(zhì)瘤特征性分子標(biāo)志物IDH-1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。IDH-1陰性組中TERTp突變數(shù)明顯高于野生型，主要是由于大部分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病例富集于IDH-1表達(dá)陰性組中，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TERTp突變率高達(dá)74.2%。單純依據(jù)膠質(zhì)瘤WHOⅡ-Ⅳ分級因素，結(jié)果顯示TERTp突變率隨著膠質(zhì)瘤級別的遞增略有升高，這種趨勢可能與TERTp突變增加了膠質(zhì)瘤的惡性表型有一定關(guān)系。

Kaplan-Meier生存分析顯示，突變型患者術(shù)后生存時(shí)間顯著低于野生型患者的生存時(shí)間(P<0.05)，與國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道較一致[6-11]。隨后進(jìn)一步分組分析發(fā)現(xiàn)，TERTp突變在星形細(xì)胞源性腫瘤中與不良預(yù)后密切相關(guān)，而在少突膠質(zhì)細(xì)胞源性組中二者并無相關(guān)性。因此可以認(rèn)為，該突變在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的突變率雖然相對較高，但并非是預(yù)后不良指標(biāo)；反之，在彌漫性星形細(xì)胞瘤到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤這一組群，可以作為一個(gè)相對特異的預(yù)后不良的分子指標(biāo)。分組預(yù)后分析中還發(fā)現(xiàn)，在≥45歲的老年患者組中，檢測TERTp突變狀態(tài)對預(yù)后有更高的指導(dǎo)意義[8]。

目前，TERTp突變作為一個(gè)獨(dú)立的腫瘤預(yù)后指標(biāo)還存在爭議，尤其在IDH-1野生型的膠質(zhì)瘤患者中。有研究表明，在術(shù)后接受正規(guī)放化療的IDH野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，聯(lián)合檢測 (MGMT)甲基化狀態(tài)和TERTp突變可以更精準(zhǔn)預(yù)測患者的預(yù)后；在細(xì)化分組中，TERTp突變且MGMT低甲基化患者預(yù)后最差，而TERTp野生型伴MGMT高甲基化患者預(yù)后較好[11]。結(jié)果提示對于膠質(zhì)瘤患者需要聯(lián)合檢測多個(gè)基因，對預(yù)測生存期具有更優(yōu)價(jià)值。后續(xù)研究將納入MGMT、ATRX、TP53、EGFR等熱點(diǎn)分子改變，進(jìn)行更加精確的分子分型為基礎(chǔ)的預(yù)后分析，尋找可能的治療靶點(diǎn)。