氮磷氯共摻雜碳量子點用于食品中檸檬黃的快速檢測

劉凌飛，孫慧娟，錢敏捷，胡 欽，楊振泉，何海林，趙盛燕，肖麗霞

（揚州大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州 225001）

檸檬黃（Tartrazine）是應(yīng)用最廣泛的偶氮類合成染料之一，為橙黃色粉末，無臭，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于油脂[1]。在食品的生產(chǎn)、加工、運輸過程中，為適應(yīng)人們對食品的感官需求，通常用檸檬黃對食品進(jìn)行調(diào)色[2]。然而，過量食用檸檬黃會嚴(yán)重危害人體健康。研究表明，檸檬黃的過量攝入會引起DNA 損傷和干擾DNA 合成以致胎兒畸形[3]；甚至?xí)D(zhuǎn)換為致癌物質(zhì)，引發(fā)皮下肉瘤、肝癌、腸癌等[4]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，檸檬黃在果凍、飲料、糖果、固體復(fù)合調(diào)味料中的最大使用量分別為0.05、0.1、0.3、0.2 g/kg[5]。因此，食品中檸檬黃含量的檢測十分必要。目前，用于檸檬黃檢測的常用方法有紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]、電化學(xué)法[8]和毛細(xì)管電泳法[9]。但是，這些方法大多需要繁瑣的樣品預(yù)處理、昂貴的設(shè)備、嚴(yán)格的操作條件和較長的分析時間，限制了它們的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，迫切需要開發(fā)簡單、快速、低成本的檸檬黃檢測新方法。近年來，快速、靈敏、低成本的熒光分析法[10]開始用于檸檬黃的測定，特別是基于碳量子點（CDs）的熒光法在檸檬黃檢測中展現(xiàn)出高靈敏度和高準(zhǔn)確性。例如，Thulasi 等[11]以汽車尾氣為原料制備氮摻雜碳量子點（N-CDs）用于檢測飲料中的檸檬黃，檢測限為26.0 nmol/L。Liu 等[12]以間苯二胺為原料，通過水熱法制備氮摻雜碳量子點（N-CDs），檢測飲料、糖果等食品中的檸檬黃，檢測限為12.4 nmol/L。Chatzimitakos 等[13]以柑橘和檸檬皮為碳源制備碳量子點，在檸檬黃的檢測中獲得了200.0 nmol/L 的檢測限。

CDs 是一種新型碳納米材料，通常呈類球形且尺寸小于10.0 nm[14]?；谄涓邿晒夥€(wěn)定性、低毒性、高水溶性和良好的生物相容性等特點，CDs 在食品添加劑的快速檢測方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢[15-17]。CDs 的制備方法簡單、成本低廉，可通過水熱法[18]、微波法[19]、超聲法[20]等方法制備。據(jù)報道，通過選擇不同的合成材料和制備方式，可以調(diào)控CDs 的發(fā)光顏色和化學(xué)結(jié)構(gòu)，提升CDs 熒光探針的靈敏度[21]?，F(xiàn)有的用于檸檬黃檢測的CDs 大多只摻雜了N，其檢測性能仍有較大提升空間，因此，需要通過改變CDs 摻雜元素提升其對檸檬黃的檢測性能。本研究以葡萄糖為碳源，乙二胺、濃磷酸、鹽酸為雜原子供體，采用酸堿中和自放熱法制備氮磷氯共摻雜碳量子點（N,P,Cl-CDs）?；跈幟庶S可以有效猝滅N,P,Cl-CDs 的熒光，構(gòu)建了一種簡單、靈敏的檸檬黃快速檢測方法；優(yōu)化了N,P,Cl-CDs 用于檸檬黃檢測的反應(yīng)條件，測試了該方法的線性范圍、選擇性和抗干擾性，探究了檸檬黃對N,P,Cl-CDs 熒光的猝滅機(jī)理；并將該方法用于實際食品樣品中檸檬黃的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HT 7800 透射電子顯微鏡TEM，日本日立高新技術(shù)公司；Cary 5000 紫外-可見-近紅外吸收光譜儀UV，美國Varian；Cary 610/670 顯微紅外光譜儀IR，美國Varian；F-320 熒光分光光度計，天津港東科技股份有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

本實驗使用試劑包括葡萄糖、乙二胺、H3PO4、濃鹽酸、檸檬黃、蛋氨酸、絲氨酸、組氨酸、L-甲硫氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸、葉酸、梔子苷、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、K2C2O4、KBr、Na2SO3、NaHSO3、NaNO2、NaF、AgNO3、KH2PO4、NaCl、FeSO4、ZnCl2、CdCl2、MgSO4，所用試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均為超純水，取自Milli-Q-RO4 超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore 公司；食品樣品，包括果凍、糖果、汽水、能量飲料和固體調(diào)味料，購自江蘇省揚州市的當(dāng)?shù)爻?。透析膜（MWCO=500～1 000 Da），美國Spectrum 公司；醋酸纖維膜（0.22 μm，13 mm 內(nèi)徑），天津津騰有限公司。

1.2 N,P,Cl-CDs 的制備

以葡萄糖為碳源，采用酸堿中和自放熱方法制備N,P,Cl-CDs。稱取0.4 g 葡萄糖置于50.0 mL 玻璃燒杯中，依次向燒杯中加入6.0 mL 乙二胺、2.0 mL H3PO4（質(zhì)量濃度85%）和2.0 mL 濃鹽酸。反應(yīng)產(chǎn)物自然冷卻至室溫，通過透析膜在1.0 L 玻璃燒杯中用超純水透析，每24 h 更換超純水，歷時3 d，得到深棕色N,P,Cl-CDs 溶液。冷凍干燥后得到深棕色N,P,Cl-CDs 粉末，置于干燥器中備用。

1.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

對包括N,P,Cl-CDs 溶液濃度、pH 值、反應(yīng)時間在內(nèi)的可能影響檸檬黃猝滅N,P,Cl-CDs 熒光效率（F0/F）的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。在沒有特殊說明的情況下，N,P,Cl-CDs溶液采用超純水配制。N,P,Cl-CDs 溶液濃度設(shè)置為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 mg/mL，PBS 緩沖液的pH 值設(shè)置為（pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），反應(yīng)時間設(shè)置為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40 min，記錄加入10.0 μmol/L 檸檬黃后F0/F 隨反應(yīng)時間的變化。設(shè)置激發(fā)波長（λex）和發(fā)射波長（λem）分別為370 nm 和447 nm，每組試驗重復(fù)5 次，取平均值。

1.4 線性范圍測定

將不同量的檸檬黃添加至2.0 mL、0.1 mg/mL 的N,P,Cl-CDs 溶液中，N,P,Cl-CDs 溶液中的檸檬黃濃度在0～100.0 μmol/L 范圍內(nèi)。記錄不同濃度檸檬黃存在下N,P,Cl-CDs 溶液的熒光猝滅效率F0/F，繪制F0/F與N,P,Cl-CDs 溶液中檸檬黃濃度的線性關(guān)系圖，其中F0和F分別為添加檸檬黃前后N,P,Cl-CDs 溶液的熒光強(qiáng)度。設(shè)置λex 和λem 分別為370 nm 和447 nm，每組實驗重復(fù)5 次取平均值。

1.5 選擇性及抗干擾性測試

為研究N,P,Cl-CDs 用于檸檬黃檢測的選擇性，向2.0 mL、0.1 mg/mL 的N,P,Cl-CDs 溶液中分別添加實際食品樣品中可能存在的干擾物質(zhì)，包含11 種氨基酸（蛋氨酸、絲氨酸、組氨酸、L-甲硫氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸）、4 種小分子（還原型谷胱甘肽、抗壞血酸、葉酸、梔子苷）、7 種陰離子（CH3COO-、Br-、SO32-、HSO3-、NO2-、F-、NO3-）、6 種陽離子（K+、Na+、Fe2+、Zn2+、Cd2+、Mg2+），N,P,Cl-CDs 溶液中干擾物質(zhì)的濃度為10.0 μM，記錄添加干擾物質(zhì)前后的F0/F。設(shè)置λex和λem分別為370 nm 和447 nm，每組試驗重復(fù)5次，取平均值。

為研究N,P,Cl-CDs 用于檸檬黃檢測的抗干擾性，向2.0 mL、0.1 mg/mL 的N,P,Cl-CDs 溶液中加入檸檬黃，再分別添加上述實際食品樣品中可能存在的干擾物質(zhì)，N,P,Cl-CDs 溶液中檸檬黃和干擾物質(zhì)的濃度均為10.0 μmol/L，記錄添加檸檬黃和干擾物質(zhì)前后的F0/F。設(shè)置λex和λem分別為370 nm 和447 nm，每組試驗重復(fù)5次，取平均值。

1.6 實際樣品測試

選取果凍、糖果、汽水、能量飲料和固體調(diào)味料作為實際食品樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。對于固體樣品，包括果凍、糖果和固體調(diào)味料，每種樣品分別稱取1.0 g，轉(zhuǎn)移至15.0 mL 離心管中，加入10.0 mL 超純水，超聲20.0 min以充分混合，12 000 r/min 離心10.0 min，取上清液。對于液體樣品，包括汽水和能量飲料，每種樣品量取10.0 mL轉(zhuǎn)移至15.0 mL 離心管中，超聲20.0 min 以除去氣泡，準(zhǔn)確量取1.0 mL 轉(zhuǎn)移至10.0 mL 離心管中，加入超純水稀釋至10.0 mL。上述樣品提取液均通過醋酸纖維膜過濾。向2.0 mL、0.1 mg/mLN,P,Cl-CDs 溶液中加入20.0 μL 過濾后的樣品提取液，充分混合，記錄添加樣品提取液前后的F0/F。設(shè)置λex和λem分別為370 nm 和447 nm，每組試驗重復(fù)5 次，取平均值。

采用高效液相色譜法[7]測定上述食品樣品中的檸檬黃含量，考察N,P,Cl-CDs 用于檸檬黃檢測的準(zhǔn)確性。色譜柱為Agilent C18（150 mm×4.6 mm id stainless steel，5 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為426 nm，流動相A 乙腈∶B 乙酸銨（20.0 mmol/L）=20∶80。

1.7 數(shù)據(jù)處理

TEM 圖像采用Nano Measurer 軟件分析，其他數(shù)據(jù)均采用Origin Pro 8.0 軟件分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 N,P,Cl-CDs 的表征

采用TEM 圖對N,P,Cl-CDs 的形貌和尺寸分布進(jìn)行表征（圖1A）。如圖所示，制備的N,P,Cl-CDs 呈類球形且保持較好的分散性。圖1A 中插圖是通過隨機(jī)計數(shù)TEM圖像中40 個顆粒的大小，得到的粒徑分布直方圖，N,P,Cl-CDs 的粒徑分布在2.40～6.28 nm 范圍內(nèi)，平均粒徑為（4.04±0.5）nm。

圖1 N,P,Cl-CDs 的（A）TEM 圖，插圖為粒徑分布直方圖和（B）FTIR 圖Fig.1 (A) TEM image and particle size distribution histogram and (B) FTIR spectrum of N,P,Cl-CDs.

采用傅里葉紅外光譜（FTIR）對N,P,Cl-CDs 表面的官能團(tuán)進(jìn)行表征（圖1B）。如圖所示，2 505～3 006 cm-1處的寬吸收峰對應(yīng)－OH 伸縮振動，1 666 cm-1和1 558 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別歸因于C=O 伸縮振動和N－H 彎曲振動，在1 368 cm-1和1 228 cm-1處分別觀察到對應(yīng)C—O、C—N 伸縮振動的吸收峰，955 cm-1和828 cm-1處的吸收峰分別歸屬于P—O—C 伸縮振動和C—Cl 伸縮振動。以上結(jié)果表明，N、P、Cl 被成功摻雜進(jìn)CDs 中。

采用紫外吸收-可見光光譜（UV-Vis）對N,P,Cl-CDs的紫外吸收性質(zhì)進(jìn)行表征（圖2A）。如圖所示，N,P,Cl-CDs 的UV-Vis 光譜在275 nm 和365 nm 處分別有吸收峰，前者是C=O 鍵n→π*躍遷導(dǎo)致的，后者是N、P 和Cl 雜原子引起的表面激發(fā)態(tài)的結(jié)果[22]。采用熒光光譜法對N,P,Cl-CDs 的熒光性質(zhì)進(jìn)行表征，N,P,Cl-CDs 的激發(fā)光譜在370 nm 處有激發(fā)峰；如圖2A 中N,P,Cl-CDs 在370 nm 激發(fā)波長下的發(fā)射光譜所示，觀察到在447 nm處有發(fā)射峰。圖2B 為N,P,Cl-CDs 在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜，當(dāng)激發(fā)波長從300 nm 增加至480 nm 時，N,P,Cl-CDs 的熒光發(fā)射峰隨之變化，表現(xiàn)出典型的激發(fā)波長依賴性。由圖2B 插圖可見N,P,Cl-CDs 溶液在365 nm紫外光的照射下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。

圖2 （A）N,P,Cl-CDs 的紫外-可見吸收光譜、熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜；（B）N,P,Cl-CDs 在不同λex 下的熒光發(fā)射光譜Fig.2 (A) UV-Vis absorption,fluorescence excitation and emission spectra of N,P,Cl-CDs;(B) Fluorescence emission spectra of N,P,Cl-CDs under different λex

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1N,P,Cl-CDs 溶液濃度對F0/F 的影響

不同濃度的N,P,Cl-CDs 溶液對檸檬黃猝滅N,P,Cl-CDs 熒光效率F0/F的影響見圖3A。由圖可知，N,P,Cl-CDs 溶液濃度在0.07～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)時，F(xiàn)0/F 較高且隨濃度變化不大；N,P,Cl-CDs 溶液濃度為0.1 mg/mL時，F(xiàn)0/F達(dá)到最大值。因此，選擇0.1 mg/mL 為N,P,Cl-CDs的最佳濃度。

圖3 N,P,Cl-CDs 濃度對檸檬黃檢測的影響Fig.3 Effects of N,P,Cl-CDs concentration on tartrazine detection

2.2.2 pH 值對F0/F的影響

不同pH 值對檸檬黃猝滅N,P,Cl-CDs 熒光效率F0/F的影響見圖4。由圖可知，在pH 2.0～5.0 范圍內(nèi)，F(xiàn)0/F較為穩(wěn)定；在pH 6.0～11.0 和以超純水（pH 5.8）為溶劑的反應(yīng)體系中，F(xiàn)0/F隨pH 值變化且在pH 9.0 時達(dá)到最大值；而在以超純水為溶劑的反應(yīng)體系中，F(xiàn)0/F與最大值與之相差不大，因此為簡化測試工作，本工作選用超純水作為N,P,Cl-CDs 的溶劑。

圖4 pH 對檸檬黃檢測的影響Fig.4 Effects of pH on tartrazine detection

2.2.3 反應(yīng)時間對F0/F的影響

反應(yīng)時間對檸檬黃猝滅N,P,Cl-CDs 熒光效率F0/F的影響見圖5。由圖可知，檸檬黃對N,P,Cl-CDs 熒光的猝滅作用在1.0 min 內(nèi)迅速完成，F(xiàn)0/F達(dá)到最大值且隨著時間增加無明顯變化。因此，本工作選擇1.0 min 為最佳反應(yīng)時間。

圖5 反應(yīng)時間對檸檬黃檢測的影響Fig.5 Effects of reaction time on tartrazine detection

2.3 檸檬黃的不同添加濃度對F0/F 的影響

在上述最佳反應(yīng)條件下，考察了不同濃度檸檬黃對N,P,Cl-CDs 熒光強(qiáng)度的影響（圖6）。隨檸檬黃濃度的增加，N,P,Cl-CDs 的熒光強(qiáng)度不斷降低，表明檸檬黃可以有效猝滅N,P,Cl-CDs 的熒光。檸檬黃濃度在0.01～15.0 μmol/L 范圍內(nèi)與N,P,Cl-CDs 的熒光猝滅效率F0/F呈良好線性關(guān)系，對應(yīng)的檢出限為9.3 nmol/L，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有的基于CDs 的熒光檢測法[11-13]。

圖6 檸檬黃濃度對N,P,Cl-CDs 熒光強(qiáng)度的影響，F(xiàn)ig.6 Influence of tartrazine concentration on the fluorescence intensity of N,P,Cl-CDs

2.4 選擇性與抗干擾性

考察了N,P,Cl-CDs 對檸檬黃和實際食品樣品中可能存在的干擾物質(zhì)（各類氨基酸、小分子及陰陽離子等）的選擇性（圖5A）。N,P,Cl-CDs 溶液中檸檬黃和其他可能存在干擾物質(zhì)的濃度均為10.0 μmol/L。如圖所示，加入檸檬黃時，N,P,Cl-CDs 的熒光顯著猝滅，而加入其他可能存在干擾物質(zhì)時，N,P,Cl-CDs 的熒光強(qiáng)度幾乎無變化。研究表明，N,P,Cl-CDs 對檸檬黃檢測具有高選擇性。

考察了基于N,P,Cl-CDs 的檸檬黃檢測方法對上述實際食品樣品中可能存在的物質(zhì)的抗干擾性（圖5B）。N,P,Cl-CDs 溶液中檸檬黃和其他可能存在干擾物質(zhì)的濃度均為10.0 μmol/L。如圖所示，在單獨加入檸檬黃和同時加入檸檬黃與干擾物質(zhì)時，N,P,Cl-CDs 的熒光猝滅效率無明顯變化。因此，基于N,P,Cl-CDs 的檸檬黃檢測方法具有良好的抗干擾性。

圖7 N,P,Cl-CDs 對檸檬黃和各類氨基酸、小分子及陰陽離子等的（A）選擇性和（B）抗干擾性Fig.7 (A) Selectivity and (B) anti-interference ability of N,P,Cl-CDs for various amino acid,small molecules,cations and anions et al

2.5 檸檬黃對N,P,Cl-CDs 的熒光猝滅機(jī)理研究

為探究檸檬黃對N,P,Cl-CDs 的熒光猝滅機(jī)理，表征了檸檬黃的紫外吸收光譜、N,P,Cl-CDs 的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（圖8A）。如圖所示，檸檬黃的紫外吸收光譜與N,P,Cl-CDs 的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜在290～650 nm 范圍內(nèi)有明顯重疊，表明檸檬黃對N,P,Cl-CDs 的猝滅作用是由熒光內(nèi)濾效應(yīng)引起的。

此外，熒光猝滅通常分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅中熒光基團(tuán)的熒光壽命不發(fā)生改變，而動態(tài)猝滅中猝滅劑的存在導(dǎo)致熒光壽命縮短[23]。本工作考察了檸檬黃對N,P,Cl-CDs 熒光壽命的影響，圖8B 為添加檸檬黃前后N,P,Cl-CDs 的熒光衰減曲線，表1 為通過熒光衰減曲線雙指數(shù)擬合（I(t)=A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2），τ1和τ2分別為兩個輻射衰減通道的時間常數(shù)，A1和A2分別為相應(yīng)的振幅）獲得的熒光壽命。研究表明，添加檸檬黃后N,P,Cl-CDs 的熒光壽命無明顯變化，表明檸檬黃對N,P,Cl-CDs 的猝滅作用是靜態(tài)猝滅。

表1 N,P,Cl-CDs 和N,P,Cl-CDs/檸檬黃熒光衰減曲線的雙指數(shù)擬合結(jié)果Table 1 Double-exponential fitting of N,P,Cl-CDs and N,P,Cl-CDs/Tartrazine decay curves

圖8 （A）檸檬黃的紫外-可見吸收光譜，N,P,Cl-CDs 的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜；(B) 檸檬黃引入前后N,P,Cl-CDs 的熒光衰減曲線Fig.8 (A) The UV-vis absorption spectrum of tartrazine,and the fluorescence excitation and emission spectra of N,P,Cl-CDs.(B) The fluorescence decay curves of N,P,Cl-CDs in the absence and in the presence of tartrazine

2.6 實際樣品測試

考察了基于N,P,Cl-CDs 的檸檬黃檢測方法在實際食品樣品檢測中的可行性和準(zhǔn)確性，結(jié)果見表2。果凍、糖果、汽水、能量飲料和固體調(diào)味料的提取液中檸檬黃的含量分別為0.09、0.06、0.10、0.08、0.09 μmol/L，樣品中檸檬黃的原始濃度分別為0.05、0.03、0.05、0.04、0.05 g/kg，加標(biāo)回收率在97.03%～105.41%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.96%～3.29%范圍內(nèi)。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測上述食品樣品中檸檬黃的含量，如表2 所示，兩種方法獲得的檢測結(jié)果具有一致性。結(jié)果表明，基于N,P,Cl-CDs 的檸檬黃檢測方法在實際食品樣品的檸檬黃檢測中具有高準(zhǔn)確性。

表2 食品樣品中檸檬黃的檢測Table 2 Detection of tartrazine in various food samples

3 結(jié)論

本研究以葡萄糖、乙二胺、鹽酸、磷酸為原料，采用酸堿中和自放熱法制備N,P,Cl-CDs，開發(fā)了基于N,P,Cl-CDs 的檸檬黃快速檢測方法。該方法具有選擇性好、抗干擾性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢，在0.01～15.0 μmol/L 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，檢測限低至9.3 μmol/L。將本方法用于實際食品樣品中檸檬黃的檢測，加標(biāo)回收率為97.03%～105.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.96%～3.29%范圍內(nèi)，與高效液相色譜法獲得的檢測結(jié)果具有一致性，準(zhǔn)確性較高。研究結(jié)果表明，本試驗基于N,P,Cl-CDs 的檸檬黃檢測方法在實際食品樣品中檸檬黃的檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。