種子細胞與生物支架在脊髓組織工程中的實驗研究進展

漆國棟，江瓊，伍亞民，漆偉

1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院骨科，重慶市 400010；2.重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市 400016；3.陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，創(chuàng)傷燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042

脊髓損傷是一種具有較高致殘率的中樞神經系統(tǒng)疾病，嚴重影響患者身心健康，在全球范圍內皆具流行性[1]。脊髓原發(fā)性損傷造成的微血管出血、組織缺血及神經元損傷與初始破壞性撞擊有關，這種損傷是不可逆的[2]。繼發(fā)性損傷在隨后數分鐘到數天內逐漸形成，會引起炎性因子大量釋放[3]、微環(huán)境的各種級聯放大反應[4]、氧化應激反應[5]等，這些都會最終導致神經細胞凋亡，從而阻止神經再生的可能。

組織工程技術在再生醫(yī)學中有著廣泛的應用，可以用來替代、恢復或增強組織功能[6]。在脊髓損傷領域，脊髓組織工程通過種子細胞與生物支架可以構建一個模擬天然脊髓外基質的微環(huán)境，能夠促進特定的細胞-基質相互作用，誘導細胞行為，促進宿主脊髓再生[7]。近期有研究對脊髓組織工程的臨床應用安全性和可行性進行評估，這些研究都通過磁共振結果、神經電生理學和神經功能評分等方法展示了患者功能恢復證據[8-9]。由于都是小樣本量臨床研究，缺乏權威證據證明其臨床可推廣性，脊髓組織工程目前仍停留在實驗研究階段以解決不斷存在的問題。本文以脊髓組織工程中的種子細胞和生物支架存在問題為切入點，對近期實驗研究進展進行綜述。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采用主題檢索方法，檢索中國知網、萬方、PubMed、Web of Science 建庫至2021 年3 月公開發(fā)表的中英文文獻。中文檢索策略：脊髓損傷AND(種子細胞OR 生物支架OR 組織工程)。英文檢索策略：spinal cord injury AND (seed cell OR biological scaffold OR tissue engineering)。同時查詢所有納入文獻的參考文獻，避免遺漏。

1.2 納入和排除標準

納入標準：①涉及種子細胞在脊髓損傷中的選擇和應用；②討論生物支架在脊髓損傷中的傳統(tǒng)用法和改良；③涵蓋各類種子細胞和生物支架復合模式的脊髓組織工程研究；④同領域選擇近5 年在權威雜志上發(fā)表的文章；⑤具有原創(chuàng)性，且文章結果可靠。

排除標準：①未出版的論文(包括學位論文、會議論文等)；②不能獲取全文；③與主題無關。

1.3 文獻篩選

由熟悉脊髓損傷的神經再生治療并了解脊髓組織工程的研究人員進行文獻篩選和分析，初檢得到文獻2386 篇，篩選后納入85 篇，其中英文82 篇，中文3篇。篩選流程圖見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

2 結果

共納入文獻85 篇，主要來自美國、中國和英國等，期刊主要來源于Biomaterials、Mater Sci Eng C Mater Biol Appl和ACS Appl Mater Interfaces等。文 獻[1-9]闡述了脊髓組織工程應用于脊髓損傷后神經再生的可行性與對抗病理過程所需面臨的挑戰(zhàn)；文獻[10-25]介紹了脊髓組織工程中種子細胞的選擇；文獻[26-43]探討了種子細胞存在的問題與近期解決方案；文獻[44-51]介紹了脊髓組織工程中生物支架的特點及傳統(tǒng)選擇；文獻[52-63]探討了生物支架存在的問題與近期解決方案；文獻[64-85]探討了種子細胞與生物支架復合構建脊髓組織工程的問題及近期不同復合模式嘗試。

2.1 種子細胞的問題及進展

脊髓組織工程選用的種子細胞可以參照臨床細胞療法。Levi 等[10]評估了人神經干細胞移植治療慢性脊髓損傷效果；最新一項納入37個細胞試驗的系統(tǒng)評價發(fā)現[11]，絕大多數臨床研究使用的細胞種類是干細胞，其次是以嗅鞘細胞、施萬細胞為代表的周圍神經細胞。本文回顧列舉一些代表性干細胞和周圍神經細胞在治療脊髓損傷時的作用機制(表1)[12-25]，發(fā)現種子細胞種類中干細胞選擇多且作用機制廣泛。因此本文首先探討干細胞作為種子細胞的問題及進展。

表1 種子細胞中的干細胞和周圍神經細胞列舉

傳統(tǒng)研究認為，干細胞作為種子細胞的問題可歸納為潛在的致癌性、免疫排斥反應和倫理道德。

致癌性方面，干細胞的DNA 修復活性、基因不穩(wěn)定、缺乏自我限制等特性與癌細胞相似，不完全分化的神經細胞會增加形成畸胎瘤的可能性[26]。為了降低腫瘤的潛在風險，通過移植前的體外細胞處理，干細胞可以通過默認路徑分化為神經祖細胞[27]。而最新的研究嘗試對神經干細胞進行光遺傳學刺激，通過低輻照度光刺激敷衍系統(tǒng)可降低其致癌性[28]。

免疫排斥方面，同種異體移植可能表達主要的組織相容性抗原導致免疫排斥反應。既往研究認為臨床細胞移植應與地塞米松等免疫抑制劑聯合應用[29]。而近年一些低免疫原性的細胞被認為可以加以利用。有學者通過可視化分析研究認為間充質干細胞的異種移植是可行的[30]，后續(xù)的機理研究揭示其低免疫原性的原因可能與在受體內可表達免疫細胞樣特征有關[31]。

倫理道德方面，人類胚胎在道德上等同于成人，為科學研究創(chuàng)造人類胚胎是不可接受的。Yamanaka等[32]首次利用病毒載體將四種轉錄因子導入小鼠成纖維細胞獲得誘導性多能干細胞，作為任意來源的萬能細胞，可以不需要用人類胚胎的成體細胞制造。一項循證研究也證實，誘導多功能干細胞能移植后可有效改善脊髓損傷大鼠模型的運動功能[33]。近期已有臨床研究通過倫理審核，將首次嘗試誘導多功能干細胞干預亞急性脊髓損傷患者[34]。

此外，無論是干細胞還是周圍神經細胞作為種子細胞，其最核心的問題是細胞移植后的低存活率和分化率，這也是近年來細胞實驗研究最集中的熱點，而相應的基因轉染技術、多細胞共移植和移植前預處理成為實驗研究進展。

首先，基因轉染技術可以將特異性核酸導入細胞并維持其生物學功能，從多方面有利于細胞的生存和分化。Tang 等[35]通過基因轉染的方法將脂肪干細胞過表達神經元素2(neurogenin2,Ngn2)，與單純脂肪干細胞移植組相比，Ngn2 過表達組神經元分化率更高，能上調腦源性神經營養(yǎng)因子、血管內皮生長因子等營養(yǎng)因子，抑制膠質瘢痕形成。Shi 等[36]建立穩(wěn)定的過表達轉谷氨酰胺酶2型(transglutaminase type 2,TG2)基因的間充質干細胞系，結果表明可以促進更高的神經元分化率，并促進神經功能的恢復。過表達胰島素樣生長因子1 (insulin-like growth factor 1,IGF-1)基因的骨髓間充質干細胞移植到小鼠脊髓挫傷模型后，相較于野生型更能提升細胞存活率、免疫調節(jié)、髓鞘形成和功能改善[37]。

其次，多細胞共移植可以相互彌補細胞之間的缺陷。施萬細胞移植由于無法遷移到脊髓遠端，無法修復脊髓外受損區(qū)域，有研究試圖將善于遷移的嗅鞘細胞與之聯合，結果表明聯合移植組在損傷區(qū)的分布范圍更廣，促進巨噬細胞表型從M(γ 干擾素)向M(白細胞介素4)轉化，并提供較好的免疫環(huán)境和減少損傷部位的炎癥浸潤，調節(jié)炎癥細胞因子和趨化因子的表達[38]?；陂g充質干細胞可能會降低神經干細胞移植后成瘤性風險的觀點，Sun 等[39]嘗試人類臍帶間充質干細胞和人類神經干細胞共移植治療大鼠脊髓挫傷，結果表明共移植組無論是移植細胞存活率還是功能改善都顯著高于單細胞移植組。脂肪干細胞具備良好的分泌體再生性，而嗅鞘細胞具備很好的遷移引導性，有研究發(fā)現將二者進行聯合移植可以減少病變部位的炎癥反應與星形膠質細胞增生[40]。

最后，一些移植前預處理方法也可以提高細胞的存活率和分化率。Zhilai 等[41]在移植人臍帶間充質干細胞前先經過5%低氧濃度培養(yǎng)，發(fā)現該方法可以增加軸突保存，并使caspase-3+細胞和ED-1+巨噬細胞數量減少。Song等[42]觀察依達拉奉聯合神經干細胞移植對大鼠脊髓全橫斷損傷修復的影響，發(fā)現依達拉奉可促進損傷區(qū)神經干細胞的存活和分化，聯合移植可提高大鼠脊髓損傷修復的效果。本研究團隊研究表明[43]，中藥單體黃芪總皂甙能促進體外培養(yǎng)神經干細胞向神經元方向分化，與激活Wnt信號通路，從而調控該通路下游促分化靶向蛋白Ngn1的表達。

2.2 生物支架的問題及進展

作為脊髓組織工程的生物支架，其基本要求可以概括為以下四點[44-45]。第一，具有良好的生物相容性和生物降解性。降解時間與神經再生的病理階段有關，支架可以與周圍組織結合，支持神經再生和成熟。第二，立體結構，高比表面積。它應該具有適當的機械性能，如強度、硬度、彈性和長度，這有利于表面材料的交換和細胞的黏附和生長。第三，足夠的神經生長因子，以保證神經再生的營養(yǎng)。第四，原料來源廣，生產方便。

本文回顧列舉了一些傳統(tǒng)生物支架在脊髓損傷中的實驗研究(表2)[46-51]。通過這些研究可以發(fā)現生物支架的問題在于單一材料選擇無法同時滿足生物相容性、生物降解和力學性能等特點，而傳統(tǒng)工藝也無法更好模擬內部結構精密的脊髓組織。因此，生物支架的進展在于材料和工藝的新選擇。

表2 傳統(tǒng)生物支架實驗研究列舉

材料選擇方面，兩種復合材料的支架逐漸成為新選擇。膠原與絲素蛋白電紡制備的支架具有較好的物理性能，同時保持良好的生物相容性。絲素蛋白降解速度慢，能為細胞提供與生長速度相匹配的支持。膠原蛋白與絲素蛋白的結合，可以改善膠原蛋白在干燥狀態(tài)下的物理性質，也可以提高薄膜的耐水性，降低熱水溶解率[52]。Kwiecien 等[53]嘗試將膠原蛋白與殼聚糖兩種材料進行復合，除了常規(guī)橋接損傷部位外，還發(fā)現可以作為載體持續(xù)性釋放搭載的生物分子制劑，從而發(fā)揮抑制炎癥等作用。有研究設計可注射納米纖維水凝膠復合材料以提供機械強度和孔隙率，發(fā)現該復合支架可在沒有任何外源性因素或細胞的情況下，對損傷脊髓提供機械支持，并支持損傷組織中的促再生巨噬細胞極化、血管生成、軸突生長和神經發(fā)生[54]。人工材料可以改善低力學性能和高降解率，反之天然材料也可以改善人工材料的低生物相容性。為了解決肽納米纖維支架力學性能差、降解率高的問題，研究人員提出聚丙交酯-乙交酯復合改性支架，結果表明新的肽支架增強了種子細胞的黏附、伸展和表型表達[55]。Ahi 等[56]采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物作為內層支架材料更好促進種子細胞生長，膠原蛋白作為外層支架材料更好促進生物分子制劑釋放，這種聚乳酸-羥基乙酸共聚物/膠原蛋白雙層支架可以更好促進神經軸突的生長。

在工藝選擇方面，模擬脊髓組織內部致密結構的靜電紡絲和3D 打印正逐漸興起。靜電紡絲是利用聚合物發(fā)射源和接地集電極之間的大電壓梯度，從聚合物溶液或熔體中提取含有微米和納米直徑纖維支架的過程，往期綜述性研究回顧了靜電紡絲技術制備脊髓支架的優(yōu)越性和實用性[57-58]。Yan等[59]利用靜電紡絲技術和復合人工材料制備出一款新型的納米纖維網，檢測后發(fā)現該支架具備更優(yōu)的親水性，可以上調多巴胺和苯胺四聚體的含量，且具備良好的電活性。Cnops等[60]將靜電紡絲技術進行改良，通過改變靜電紡絲時間可以得到不同纖維密度的支架，結果表明具有高纖維密度以及纖維束之間大量的小間隙的支架對促進神經再生更加有利。3D 生物打印通過特制“生物墨水”，以計算機三維模型為“圖紙”，實現快速原型打印，構建復雜的組織結構，最終制造出人造器官和生物醫(yī)學產品，目前該技術在骨組織工程的基礎研究已得到長足發(fā)展并已延伸到臨床應用，充分體現了該技術在人體器官再生中的潛力[61]。脊髓組織作為3D 打印研究的熱點之一，Koffler 等[62]使用微尺度連續(xù)投影打印方法可在1.6 s內打印出適合嚙齒動物脊髓大小的三維仿生水凝膠支架，并可根據人類脊髓大小和損傷形狀進行縮放；并且該支架可通過種植神經前體細胞形成突觸并伸入損傷下方的宿主脊髓，以恢復突觸傳遞并顯著改善功能結局。Sun 等[63]將膠原/殼聚糖作為打印材料，發(fā)現3D 打印的支架對大鼠全橫斷脊髓模型具有顯著的治療作用，相較于傳統(tǒng)凍干支架可顯著促進神經功能恢復。

2.3 種子細胞-生物支架復合的問題及進展

脊髓組織工程的構建是指種子細胞與生物支架的復合，具體又可以分為體內復合和體外復合。體外復合是將細胞種植在具有三維結構的支架上，在培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，使細胞在三維支架中遷移和生長，最終形成細胞-支架復合體。體內復合就是將細胞-支架復合體整體移植入體內，然后在體內完成組織的形成和支架材料的降解。體外復合是前提，體內復合是延續(xù)。近年來如何選擇有效的細胞-支架復合模式已成為脊髓組織工程實驗研究的新熱點[64]。

復合的核心問題在于不同種子細胞與生物支架的模式會帶來不一樣的效果，有些有益，有些無用，有些甚至有害。搭載生物分子的纖維蛋白支架種植胚胎干細胞，移植后導致細胞存活率降低和巨噬細胞浸潤增加[65]。而在自組裝肽納米纖維支架種植靈長類神經干細胞進行體外培養(yǎng)并不會導致細胞分化率有顯著差異[66]。在此，本文回顧并列舉了一些有代表性的近期脊髓組織工程中種子細胞與生物支架復合模式[67-80]，主要包含前文提及的種子細胞種類與生物支架新選擇，這或許能為接下來嘗試不同種子細胞與生物支架復合模式提供研究方向(表3)。此外，生物制劑等其他因素的引入，也為復合模式提供了新的思路。由于使用了包裹生物制劑的支架，可以通過緩釋生物制劑使種子細胞具有較高的細胞活性，具有良好的細胞分布和表型，并且在移植后期表現出很強的生物相容性[81]。Li 等[82]在單純膠原支架上搭載西妥昔單抗，結果表明這套功能性支架可以促進支架上的神經元分化、成熟，髓鞘和突觸的形成，并可以極大降低硫酸軟骨素蛋白聚糖沉積在病變部位?；谧仙即寄軠p少膠質瘢痕，加強內在軸突再生的觀點，有研究制備了可以在體內長時間釋放紫杉醇的膠原蛋白支架，在種植神經干細胞后移植到T8脊髓完全橫斷模型中，結果表明該模式提供了一個有益的神經干細胞分化為神經元的微環(huán)境，促進神經元再生和軸突延伸，最終改善運動誘發(fā)電位和下肢運動的恢復[83]。

表3 近期脊髓組織工程種子細胞-生物支架復合模式列舉

3 小結

脊髓損傷康復臨床路徑包括急性期重建脊柱和神經減壓外科治療，以及亞急性和后期綜合康復[84]。而脊髓組織工程有潛力徹底改變脊髓損傷治療路徑。脊髓組織工程首先通過手術挽救脊髓功能，接著通過支架上的種子細胞促進受損脊髓的再生和替代受損神經元樣細胞，然后支架的橋接作用增強再髓鞘，最后在各種因素的協(xié)同作用下，整個機體得到最大程度的康復。本文簡要闡述脊髓組織工程中的種子細胞與生物支架各自及復合時存在的問題及進展，而在實踐研究中，研究者既可以單純改良種子細胞或者生物支架，也可以共同改良。如Ji 等[85]對種子細胞與生物支架同時進行改良，首先通過基因轉染技術將高表達腦源性神經營養(yǎng)因子和神經營養(yǎng)素3 的脂肪干細胞作為種子細胞，然后首次選用絲素蛋白/殼聚糖復合材料制備生物支架，最后以此作為新型復合模式移植到大鼠脊髓損傷模型中?？傊磥淼膶嶒炑芯靠梢試L試以解決種子細胞與生物支架問題作為基礎，重點深入探索適宜的復合模式，從而為臨床應用轉化提供依據。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。