熱處理提高采后果蔬低溫貯藏期間活性氧清除能力的機制

胡均如，張敏,2,3,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2 (上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(上海冷鏈裝備 性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海，201306)4(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306)

果蔬采后仍是活生命體，因其含水量高、保護組織差而易受機械損傷，屬于易腐爛商品，加之流通環(huán)節(jié)冗長、冷藏鏈設(shè)施不普及，因而采后腐損率較高。隨著我國農(nóng)產(chǎn)品冷鏈、冷藏庫體系建設(shè)不斷完善，采用冷鏈物流結(jié)合低溫貯藏技術(shù)可以有效降低采后果蔬的腐損率[1-3]。其中低溫貯藏作為廣泛使用的采后技術(shù)之一，是果蔬采后處理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。適宜的低溫在減緩果蔬新陳代謝速率、減少品質(zhì)劣化等方面起著重要作用，可以有效延長果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的保質(zhì)期、減少經(jīng)濟損失[1,4]。

然而，研究發(fā)現(xiàn)低溫雖能顯著延長果蔬的貯藏期，但當對冷敏感的果蔬在冷藏溫度下貯藏和運輸時會產(chǎn)生低溫脅迫，導致機體發(fā)生氧化損傷，造成植物細胞生理功能紊亂從而導致冷害現(xiàn)象的發(fā)生，其癥狀包括嚴重的點蝕、凹陷、水分流失、花萼變黑、局部區(qū)域浸水和腐爛等[5-8]，冷害現(xiàn)象通常在果蔬從低溫環(huán)境轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境一定時間后才會表現(xiàn)出來，這嚴重影響到果蔬的食用品質(zhì)和商業(yè)價值[9]。研究發(fā)現(xiàn)，冷害現(xiàn)象是冷敏果蔬在低溫貯藏期間遭受低溫脅迫后產(chǎn)生嚴重細胞生理紊亂的外在表現(xiàn)，而低溫脅迫通常主要引起植物機體氧化損傷[10]。

熱處理是一種無毒、安全有效的可以控制采后生理紊亂，保持園藝作物質(zhì)量的采后貯前預(yù)處理物理手段，熱處理的應(yīng)用被國內(nèi)外學者認為是降低采后果蔬低溫貯藏期間冷害發(fā)生的有效技術(shù)[11-15]。ENDO 等[8]和SUZUKI等[16]的研究表明，植物經(jīng)過適當?shù)臒崽幚砗螽a(chǎn)生耐熱性的能力是通過增強其細胞機制介導的，該機制可防止植物在熱脅迫下的氧化損傷；輕度的熱應(yīng)激會激活植物細胞中的信號傳導途徑，使植物細胞中抗氧化酶的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平因輕度熱應(yīng)激而升高，在植物機體中引起抗氧化反應(yīng)，并且在進入冷脅迫環(huán)境時該抗逆機制仍然起作用。因此，貯前熱處理可以促使果蔬等園藝作物更加適應(yīng)低溫貯藏環(huán)境[11,17]。

本文概括了熱處理對采后冷藏果蔬機體中活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除系統(tǒng)的主要作用，綜述了國內(nèi)外學者關(guān)于熱處理對采后果蔬低溫貯藏期間ROS清除系統(tǒng)影響的研究進展，旨在為貯前熱處理技術(shù)減輕采后果蔬低溫貯藏期間氧化損傷、冷害現(xiàn)象的更深入研究提供理論依據(jù)。

1 采后果蔬低溫貯藏期間活性氧清除系統(tǒng)變化

HODGES等[19]、MITTLER[21]、王馨等[22]及王思奇[23]國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)植物機體抗氧化系統(tǒng)受環(huán)境調(diào)控顯著，必要時適當施加脅迫可使植物機體氧化還原狀態(tài)穩(wěn)定。SHAROM 等[24]、SALTVEIT[25]學者認為低溫貯藏雖能有效降低番茄等果蔬代謝水平、抑制ROS的產(chǎn)生從而延長貯藏期，但在低溫貯藏期間，環(huán)境溫度的大幅降低會使果蔬機體內(nèi)的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH) 及抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)等物質(zhì)的活性受到抑制從而導致果蔬活性氧清除能力減弱，使果蔬機體仍遭受氧化損傷且會產(chǎn)生冷害現(xiàn)象導致果實商業(yè)價值降低。為解決這一約束低溫貯藏效果的現(xiàn)象，解越[26]、朱賽賽等[27]、李春暉等[28]及邵婷婷等[12]發(fā)現(xiàn)引入貯前熱處理技術(shù)可有效上調(diào)低溫貯藏期間青椒[12]、黃瓜[26]、西葫蘆[27-28]等果實的抗氧化酶如CAT、SOD及APX等的活力，減少冷害的發(fā)生。果蔬低溫貯藏過程中涉及到的ROS酶促清除系統(tǒng)主要包括:CAT、APX、SOD、單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)以及過氧化物酶(peroxidase，POD)等[29]；果蔬低溫貯藏過程中ROS非酶促清除系統(tǒng)主要包括GSH、AsA、脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)、單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbic acid，MDHA)等[18]?；钚匝趺复倥c非酶促清除系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)合作，維持著果蔬機體內(nèi)部氧化-還原水平的動態(tài)平衡，保持了機體的正常生命活動[30]。如圖1所示，SOD是植物細胞中直接清除超氧陰離子自由基的第一道防線，與POD、CAT以及APX等協(xié)同構(gòu)成了植物機體活性氧清除系統(tǒng)的基礎(chǔ)防線；其他抗氧化酶如GR、MDHAR和DHAR等與重要還原性物質(zhì)AsA和GSH一起構(gòu)成GSH-AsA循環(huán)，該循環(huán)在清除H2O2過程中起著重要作用[21,31-32]。

APX-抗壞血酸過氧化物酶；AsA-抗壞血酸；CAT-過氧化氫酶； MDHA-單脫氫抗壞血酸；MDHAR-單脫氫抗壞血酸還原酶； DHA-脫氫抗壞血酸(氧化型抗壞血酸)；DHAR-脫氫抗壞血酸還原酶； GR-谷胱甘肽還原酶；GSH-谷胱甘肽；GSSG-氧化型谷胱甘肽； SOD-超氧化物歧化酶圖1 采后果蔬的主要活性氧清除系統(tǒng)[21,31]Fig.1 The main active oxygen scavenging system in postharvest fruit and vegetables

2 熱處理提高采后果蔬低溫貯藏期間主要抗 氧化酶活性

CAT是果蔬中活性氧清除系統(tǒng)的主要酶之一，當果蔬機體受到氧化脅迫產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時被激活。SEVILLANO等[39]使用基因改造策略對轉(zhuǎn)基因番茄進行的分析證實了CAT同工型酶是抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)氧化應(yīng)激而觸發(fā)的關(guān)鍵元素。環(huán)境脅迫既能導致CAT活性的增強也能導致其減弱，這取決于脅迫的強度、持續(xù)時間和類型，當?shù)蜏刭A藏時的冷脅迫抑制CAT活性時，提供適當熱脅迫的貯前熱處理可能幫助植物細胞抵抗這一過程[29,40]。NASEF[41]對黃瓜進行55 ℃，5 min的短時熱處理后再低溫貯藏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫貯藏期間該處理后黃瓜果實的CAT活性和抗冷性高于對照組。ZHANG等[42]研究發(fā)現(xiàn)，對西蘭花進行熱激處理后提高了其CAT 和其他抗氧化酶的活性，同時抑制了低溫貯藏期間H2O2含量的增加。邵婷婷等[12]將青椒果實經(jīng)過44 ℃熱水處理12 min后進入4 ℃貯藏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青椒果實的冷害指數(shù)和失重率得以降低，可能是由于熱處理激發(fā)了青椒果實中的CAT活性,從而提高了低溫貯藏期間青椒果實清除ROS自由基的能力。WANG等[43]將香蕉果實進行52 ℃，3 min的熱水處理，有效地減弱了香蕉在7 ℃ 貯藏下的冷害癥狀，并在低溫貯藏期間維持了較高的 CAT活性。類似地，熱處理誘導果蔬低溫貯藏期間CAT活性的保持和增強、同時減輕低溫貯藏期間冷害并抑制H2O2含量增加的現(xiàn)象在甜椒[8]、西葫蘆[27,33]、黃瓜[37]和鮮棗[36]等果實中也有發(fā)現(xiàn)。

APX是分布于葉綠體、線粒體、微體和胞漿的植物細胞中分解H2O2的關(guān)鍵酶。APX利用2個抗壞血酸分子將H2O2還原成水，同時產(chǎn)生MDHA(圖1)，與SOD和CAT協(xié)同清除機體內(nèi)的ROS，延緩和抑止植物細胞過氧化作用[22,31]。當植物暴露于各種環(huán)境脅迫中時，植物抵抗氧化脅迫的機制開始啟動，如溫度應(yīng)激通常激活細胞信號傳導途徑和細胞反應(yīng)，隨后產(chǎn)生APX等氧自由基清除劑[44]。ENDO等[8]采用45 ℃熱水處理甜椒15 min后再將其放入6 ℃冷藏，誘導了甜椒的耐寒性，顯著提高了低溫貯藏期間甜椒中APX活性并同時延緩了AsA含量的降低。WANG等[45]研究者發(fā)現(xiàn)，52 ℃熱處理3 min后在 20 ℃放置1.5～6 h 的香蕉果實中APX活性和其基因的表達顯著增強，放置后進入7 ℃低溫貯藏時，香蕉果實APX 的基因表達也始終高于對照，這表明熱激處理顯著上調(diào)了香蕉果實細胞中抗氧化酶的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平。趙昱瑄等[37]在研究熱處理對黃瓜果實不同部位活性氧代謝的影響時，發(fā)現(xiàn)熱處理顯著抑制了低溫貯藏期間黃瓜尾部APX活性的下降。類似地，熱處理誘導果蔬低溫貯藏期間APX活性增強并延緩AsA水平下降的現(xiàn)象在香蕉[43]和番茄[29]等果實中也有表現(xiàn)。

POD廣泛分布于植物界，除參與H2O2的清除過程外也參與如傷口愈合和木質(zhì)化等生理過程[41]，此外，早有BURRIS[46]和WANG[33]研究發(fā)現(xiàn) POD在分解過氧化氫的同時會產(chǎn)生新的自由基，因此國內(nèi)外研究者對于POD活性怎樣反映植物體內(nèi)氧化損傷狀態(tài)尚無定論。VICENTE等[47]研究者認為較高的POD活性反映了植物組織較高的損傷進程，而較低的POD活性表明組織的損傷較?。慌c此相一致的是WANG[33]早期發(fā)現(xiàn)熱處理提高H2O2的消除程度的同時降低了西葫蘆的POD活性，同樣的，NASEF[41]發(fā)現(xiàn)在冷藏和模擬貨架期期間，55 ℃短時熱處理提高黃瓜耐冷性的同時其POD活性也低于對照組，且冷藏期間黃瓜中POD活性與冷害和電解質(zhì)外滲率的發(fā)展呈正相關(guān)。而其他研究者持另一觀點，DOORN 等[48]、IMAHORI等[29]認為 POD與防御非生物和生物脅迫有關(guān)，并且在脅迫條件下其作為有效的過氧自由基淬滅劑的角色占主導地位，因此環(huán)境的各種壓力條件會導致植物體內(nèi)POD活性的增加，BASSAL等[49]通過熱水預(yù)處理提高了橙果低溫貯藏過程中POD和CAT的活性，減少了低溫貯藏過程中橙果實的冷害，朱賽賽等[27]國內(nèi)學者通過熱水處理誘導了西葫蘆果實低溫貯藏期間的抗冷性，其POD 活性在貯藏后期大幅度提升，使15 d 貯藏結(jié)束時，35 ℃ 熱水處理 10 min 西葫蘆的冷害程度明顯低于對照?？傊?，國內(nèi)外研究學者關(guān)于熱處理對采后果蔬低溫貯藏期間過氧化物酶活性趨勢影響的研究結(jié)論并不完全一致，仍在探索過程中。

3 熱處理維持采后果蔬低溫貯藏期間AsA- GSH循環(huán)

植物體內(nèi)的活性氧清除劑除幾個關(guān)鍵的抗氧化酶外，還原物質(zhì)如AsA和GSH以及維持它們生成水平的相關(guān)酶類(如MDHAR、DHAR、GR等)所構(gòu)成的AsA -GSH循環(huán)在植物活性氧清除系統(tǒng)中也起著至關(guān)重要的作用[8,31]。AsA -GSH循環(huán)是果蔬等植物體內(nèi)清除活性氧的重要途徑，這一途徑存在于植物細胞的多種細胞器中, 例如細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等。AsA是果蔬機體中重要的抗氧化劑，具有強的還原性，在APX催化H2O2分解的過程中作為還原劑易被氧化成MDHA，但AsA與MDHA的轉(zhuǎn)換是可逆的(圖1)。MDHA還原生成AsA有3條路徑：(1)可自發(fā)還原生成AsA；(2)可在MDHAR的催化下再生為AsA；(3)可自發(fā)氧化脫氫生成DHA，DHA可進一步在DHAR的催化下還原為AsA[21,31]。DHA具有強的氧化性，當植物細胞中DHA含量過高時會破壞細胞的氧化還原平衡，對植物機體造成氧化損傷[21]。DHAR是植物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，也是植物AsA-GSH循環(huán)中能夠促進AsA再生的關(guān)鍵酶，它可以催化DHA還原為AsA，從而保持細胞內(nèi)AsA的動態(tài)平衡[50-51]。但同時DHAR易使GSH催化氧化為GSSG，GSSG含量過高時會破壞植物細胞氧化還原平衡，因此作為植物中AsA-GSH循環(huán)重要成員的GR就顯得同樣關(guān)鍵，GR是一種黃素酶，在植物機體許多組織都有分布，可催化GSSG還原為GSH從而維持植物細胞內(nèi)充足的GSH水平[8,52]。

AsA作為果實重要的貯藏與營養(yǎng)品質(zhì)的同時也是果蔬體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的重要抗氧化物質(zhì)。環(huán)境脅迫中低溫或高溫脅迫都可能會激活A(yù)sA的生物合成基因以及維持AsA合成前體物質(zhì)的含量，這表明人為施加適當?shù)臏囟让{迫時(如貯前熱處理和低溫貯藏)可能有助于植物體內(nèi)AsA的生物合成[53-54]。IMAHORI等[29]的研究結(jié)果表明，與對照相比，52 ℃，15 min的熱水處理明顯提高了番茄果實中AsA的含量。馬雪梅等[55]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)35～45 ℃ 熱水處理10 min左右的草莓果實中AsA含量高于對照組，且在貯藏過程中維持了較高的AsA水平。李君蘭等[36]在探究熱空氣處理對鮮棗的影響時發(fā)現(xiàn)45 ℃、2 h的熱空氣處理能保持鮮棗中AsA和TA的含量。馬素娟[56]采用47 ℃，3 h的熱空氣處理，保持了楊梅果實較高的AsA含量,減少了果實重量損失。趙云峰等[54]通過50 ℃熱水處理龍眼果實10 min后再低溫貯藏，發(fā)現(xiàn)龍眼果肉AsA 含量高于對照，且在低溫貯藏第4天和第8天達到顯著水平，作者分析原因認為可能是熱處理維持了較高水平的AsA合成前體物質(zhì)，從而保持了低溫貯藏期間龍眼果肉的抗氧化能力。類似地，在關(guān)于蜜橘[34]、火龍果[57]等果蔬熱處理的研究中也發(fā)現(xiàn)了熱處理誘導果蔬體內(nèi)AsA含量的提高和維持。

MDHAR和DHAR是植物體中的AsA -GSH循環(huán)的重要組成部分，該循環(huán)是植物中ROS清除系統(tǒng)關(guān)鍵的一環(huán)。當AsA在植物組織中被氧化時會生成MDHA，MDHA會自發(fā)的進一步脫氫生成DHA，而MDHAR和DHAR作用便是分別負責直接從MDHA和DHA再生AsA。當植物在低溫貯藏過程中遭受低溫脅迫時會產(chǎn)生H2O2，H2O2作為ROS物質(zhì)，其升高的信號會激活植物細胞信號傳導系統(tǒng)，從而刺激MDHAR和DHAR活性的增加[8,58]。據(jù)SHIGENAGA等[59]報道熱處理帶來的適當熱脅迫使果實產(chǎn)生了較高H2O2從而誘導了花椰菜中MDHAR和DHAR的激活；同樣地，ENDO等[8]的研究發(fā)現(xiàn)熱水處理后低溫貯藏的甜椒果實中H2O2的含量短暫增加以及MDHAR和DHAR活性的增強。WANG等[60]在熱空氣處理桃果實時發(fā)現(xiàn)了MDHAR和DHAR轉(zhuǎn)錄水平短暫且急劇的上調(diào)，而這些影響被認為與熱處理時較高的H2O2濃度有關(guān)，H2O2作為信號和基因表達的調(diào)節(jié)劑具有反應(yīng)性，可增強應(yīng)激反應(yīng)和防御途徑，因此，MDHAR和DHAR的較高活性對直接減少H2O2的積累也起著重要作用[60]。

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，是一種重要的生物功能因子，它廣泛分布于植物機體內(nèi)，具有抗氧化、清除自由基的作用，在維持細胞生理功能方面起著重要的作用。GSH作為植物體活性氧清除系統(tǒng)中十分重要的非酶類抗氧化劑，是組成GSH- AsA循環(huán)的關(guān)鍵部分，其含量能直接指示果蔬抵抗活性氧有害影響的能力[61]。陳楚英等[34]研究 37 ℃、36 h 熱空氣處理對新余蜜橘采后活性氧代謝的影響時發(fā)現(xiàn)熱處理維持了低溫貯藏期間蜜橘果實較高的GSH含量。邵婷婷等[61]采用50 ℃強制對流熱空氣對青椒果實進行20 min的處理，發(fā)現(xiàn)能夠推遲低溫貯藏期間青椒果實的冷害發(fā)生時間以及保持其較高水平的GSH的含量，從而維持青椒果實AsA-GSH循環(huán)的動態(tài)平衡以提高其低溫貯藏期間的活性氧清除能力。姜雪等[62]研究發(fā)現(xiàn)初始溫度為25 ℃的西葫蘆果實經(jīng)43.3 ℃、28.4 min的熱水處理后保持了GSH的高含量，維持了低溫貯藏期間西葫蘆果實的活性氧清除能力。

GR是生物體內(nèi)氧化還原體系中最重要的酶之一，是維持細胞中GSH含量的關(guān)鍵酶。當GSH發(fā)生氧化生成GSSH時，GR在NADPH參與下可將GSSH轉(zhuǎn)化為GSH，后者是維持細胞和組織氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要非酶類抗氧化物質(zhì)[32]，GR和GSH都是維持植物體活性氧清除系統(tǒng)中AsA -GSH循環(huán)必不可缺的重要物質(zhì)。張騰國等[63]在研究逆境脅迫對油菜GR活性及其基因表達的影響時發(fā)現(xiàn)GR1和GR2基因的轉(zhuǎn)錄以及GR活性均受到低溫和高溫等環(huán)境脅迫的誘導，表明油菜GR在抵御低溫和高溫等環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。GILL等[64]研究發(fā)現(xiàn)GR與植物的抗逆性有著密切聯(lián)系，條件脅迫能誘導GR基因的表達, 誘導植物機體中GR活性的增加，從而維持植物機體抵御氧化損傷的能力。

4 總結(jié)與展望

果蔬采后仍在進行新陳代謝等生命活動，代謝過程中會伴隨ROS的產(chǎn)生，而當環(huán)境條件改變時，果蔬的細胞活動也受到影響。低溫貯藏是廣泛應(yīng)用的果蔬等園藝產(chǎn)品采后貯藏手段，可以有效地延長果蔬的貯藏期，但對低溫敏感的果蔬在較低的溫度下貯藏時不可避免的會產(chǎn)生低溫脅迫，低溫脅迫會破壞果蔬機體中ROS的產(chǎn)生與消除之間的平衡，導致ROS的積累從而導致果蔬機體的衰老與死亡。果蔬體內(nèi)自身存在著抵抗氧化應(yīng)激的ROS清除系統(tǒng)，由SOD、CAT、POD、APX以及AsA -GSH循環(huán)等構(gòu)成。適度的熱應(yīng)激會激活植物細胞中的信號傳導途徑，并在植物中促進ROS清除系統(tǒng)，使果蔬在進入冷脅迫環(huán)境時仍處于高度防御氧化損傷的狀態(tài)，因此貯前熱水處理可以促使果蔬等園藝作物更加適應(yīng)低溫貯藏環(huán)境。

目前關(guān)于熱處理調(diào)控果蔬ROS清除系統(tǒng)的研究只是從宏觀上分析了低溫貯藏期間果蔬機體抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)在不同熱處理條件下含量的變化趨勢，而對于熱處理后果蔬細胞中的ROS信號傳導途徑、抗氧化酶的基因表達與轉(zhuǎn)錄水平變化等還研究較少。因此，需要進一步研究熱處理如何增強采后果蔬細胞中的信號傳導途徑，以及活性氧信號分子對抗氧化酶基因表達的影響，為果蔬貯前熱處理技術(shù)的應(yīng)用提供更深入的理論依據(jù)。