超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中五種水溶性維生素的含量

薛霞，趙慧男，魏莉莉，丁一，宿書芳，盧蘭香，王駿，劉艷明*，胡梅

1(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南， 250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南， 250101)

蜂蜜作為一種營養(yǎng)豐富的天然保健品，深受廣大消費(fèi)者青睞。蜂蜜除了果糖、葡萄糖外，還含有各種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、多酚類、黃酮類、多糖、活性酶和類胡蘿卜素等活性物質(zhì)，因此，蜂蜜具有抗氧化、抗菌、促進(jìn)心腦和血管功能等生理功能[1-2]，常服用蜂蜜對心臟病、高血壓等疾病都有良好的輔助醫(yī)療作用。水溶性維生素是人體維持正常生理功能所必須的一類微量有機(jī)物質(zhì)，適量攝取對生長、代謝、發(fā)育都起到了積極的促進(jìn)作用。水溶性維生素檢測方法主要包括微生物方法[3-4]、液相色譜法[5-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17]。微生物法靈敏度高但步驟繁瑣、檢驗(yàn)周期長。液相色譜法前處理相對簡單，但多種維生素同時檢測存在一定困難，主要因?yàn)樽贤鈾z測器選擇性較差，易受基質(zhì)干擾；部分化合物沒有生色基團(tuán)，紫外檢測器靈敏度較低，經(jīng)常需要衍生化操作，衍生條件限制了多種化合物的同時檢測。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度、高精確度、高通量的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多種食品基質(zhì)中水溶性維生素的測定。

對水溶性維生素檢測的報道大多集中在飲料[5,11-13]、保健品[6]、嬰幼兒配方食品[14-16]、特殊醫(yī)學(xué)配方食品[17]等基質(zhì)，對于蜂蜜中多種水溶性維生素含量測定的研究較少[7,18-20]。因維生素化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)差異大，已報道的文獻(xiàn)方法大多未采取凈化措施。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在選擇性和靈敏度方面優(yōu)勢明顯，但基于其檢測原理，基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)很容易影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。同位素內(nèi)標(biāo)是解決基質(zhì)影響最好的辦法，但內(nèi)標(biāo)價格昂貴，且未完全普及。為有效解決ME對蜂蜜中多種維生素定量結(jié)果的影響，本文建立了以甲酸銨溶液作為提取溶劑，HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化的前處理方法。該過程有效去除了蜂蜜中糖分、氨基酸等物質(zhì)對目標(biāo)物的影響，實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中5種水溶性維生素的準(zhǔn)確定量分析。

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了蜂蜜中維生素B1、維生素B2(核黃素)、吡哆醇、泛酸維生素B5)和生物素(維生素B7)的分析方法。該方法前處理過程簡單，回收率和精密度滿足方法確認(rèn)要求。除生物素靈敏度與國家標(biāo)準(zhǔn)[4]相當(dāng)外，其他化合物的靈敏度比現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)[8-10]高10～20倍。蜂蜜中維生素是其天然品質(zhì)的體現(xiàn)，屬于微量營養(yǎng)成分，其含量的檢測對方法的靈敏度要求較高。本研究建立的方法既能提供較高的靈敏度，又能實(shí)現(xiàn)多種維生素同時檢測，非常適用于蜂蜜中多種水溶性維生素含量的同時測定。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30AD-8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧電離源)，日本Shimadzu公司；3-18K臺式高速離心機(jī)，德國Sigma公司；MS303S電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；MS3型旋渦混合器，德國IKA公司；SB-800DTD超聲清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 樣品處理

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取2.5 g試樣(精確至0.001 g)于25 mL比色管中，加入20 mL提取液渦旋混勻至蜂蜜完全溶解，冰水浴超聲15 min，取出后恢復(fù)至室溫，用提取液定容至刻度，搖勻，得到試樣溶液。若樣品中有少量花粉，可用濾紙過濾，收集濾液待用。

樣品凈化：依次用5 mL甲醇，5 mL水活化HLB固相萃取柱。移取1 mL上清液，以不高于1.0 mL/min的流速全部通過固相萃取柱，棄去流出液；用1 mL提取液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干；用1 mL甲醇洗脫并收集全部洗脫液。40 ℃氮吹至近干，初始流動相定容至1 mL，渦旋混勻后，經(jīng)微孔濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測定。試驗(yàn)過程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。

1.3 LC-MS/MS條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，或性能相當(dāng)者；流動相：A為20 mmol/L甲酸銨溶液，B為甲醇，洗脫梯度見表1；流速：0.35 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for UPLC separation

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI源)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reation monitoring,MRM)；掃描方式：正離子模式掃描；霧化氣流量：3 L/min；加熱氣流量：10 L/min；接口溫度：300 ℃；DL管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；干燥氣流量：10 L/min。

5種維生素的定量離子對、定性離子對、駐留時間、Q1 Pre 偏差、Q3 Pre 偏差見表2。

拋填片石、黏土比例一般按1：1，片石強(qiáng)度要求≥30MPa，尺寸約15～25cm。黏土需具有較好的黏性，一般采用將黏土潤濕捏成黏土球，直徑約10～15cm，或者采用拋填袋裝黏土方式，效果強(qiáng)于將黏土散投入孔。對于埋深較深或洞高較大的溶洞，為加強(qiáng)填充圓臺的穩(wěn)固性能，可摻入適當(dāng)PO32.5級水泥，水泥用量占黏土的1/3左右，水泥采用袋裝拋填方式較好。也可采用在拋填片石黏土中摻入稻草、麻繩的方式，稻草、麻繩能起到加筋效果，能有效提高片石、黏土圓臺的穩(wěn)固性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

這5種維生素化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有伯胺、仲胺基團(tuán)或含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，易被電離成正離子。本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源，在正離子掃描模式下對化合物進(jìn)行母離子掃描，獲得化合物的準(zhǔn)分子離子峰；在產(chǎn)物離子掃描模式下，以各個化合物的準(zhǔn)分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，獲得碎片離子信息，選擇豐度較強(qiáng)，基質(zhì)干擾較小的兩對離子為為定性定量離子；在MRM模式下，優(yōu)化碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

表2 五種維生素質(zhì)譜檢測條件Table 2 MS/MS parameters of 5 kinds of vitamins

維生素B1、吡哆醇和泛酸極性較強(qiáng)，在常規(guī)C18柱上保留較弱。本實(shí)驗(yàn)選擇了Waters HSS T3色譜柱進(jìn)行分離，該色譜柱對極性化合物保留較強(qiáng)。流動相組成能夠影響目標(biāo)化合物的分離、峰形和離子化效率，在相同的梯度洗脫條件下，分別考察甲醇-0.1%甲酸、甲醇-甲酸銨、甲醇-甲酸銨(含0.1 %甲酸)、乙腈-甲酸銨等4種流動相在HSS T3 色譜柱上對目標(biāo)化合物分離情況、靈敏度、峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸和酸化甲酸銨做流動相時，維生素B1保留時間在1 min左右，峰形拖尾；泛酸在酸性條件下色譜保留更好但響應(yīng)值低。甲酸銨做流動相時各化合物保留時間適中，峰形對稱，且響應(yīng)值均比甲酸條件下更高。當(dāng)有機(jī)相為乙腈時，保留時間稍短，目標(biāo)物峰形和響應(yīng)值變化不大。綜上，本研究選擇甲醇-甲酸銨體系進(jìn)行色譜分離。

研究還考察了10、20和50 mmol/L這3個濃度水平的甲酸銨做流動相時對目標(biāo)物的影響。發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度增加，泛酸保留時間逐漸由2.31 min增加至2.49 min，響應(yīng)值也明顯增加，維生素B1、維生素B2、吡哆醇和生物素受鹽濃度影響很小。鹽濃度越高在色譜系統(tǒng)析出的風(fēng)險越大，流動相中鹽濃度的增加也會增加質(zhì)譜離子源部分的霧化難度。在20 mmol/L條件下，泛酸響應(yīng)值已很好，完全滿足蜂蜜的檢測需求，因此，最終選擇甲醇-20 mmol/L甲酸銨為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，使目標(biāo)物與雜質(zhì)組分有效地分離，峰形良好，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖見圖1。

A-維生素B1；B-維生素B2;C-泛酸；D-吡哆醇；E-生物素圖1 五種維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 5 kinds of vitamins standard solution

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

5種待測目標(biāo)物均易溶于水，在酸性或中性溶液中穩(wěn)定性較好。蜂蜜中大量的糖分、氨基酸、礦物質(zhì)等也易溶于水，水系溶劑能使樣品均勻分散，更有利于目標(biāo)物的提取，為此本實(shí)驗(yàn)選擇不同pH值的水溶液作為提取溶劑。分別考察了0.1 mol/L鹽酸溶液(提取液1)、0.1%甲酸溶液(提取液2)、pH值4.5的甲酸-甲酸銨溶液(提取液3)、20 mmol/L甲酸銨溶液(提取液4)和純水(提取液5)5種提取溶劑的提取效率，結(jié)果如圖2所示。低pH值條件下，維生素B1和吡哆醇均呈離子化狀態(tài)，影響了其在固相萃取柱(solid phase extraction,SPE)SPE柱上的保留，回收率明顯偏低；pH低于4.5時生物素回收率較低，甲酸銨和水作為提取劑時生物素回收率無區(qū)別。因蜂蜜中含有多種有機(jī)酸，用純水做為提取溶劑時，蜂蜜的提取溶液呈酸性，維生素B1回收率較低。維生素B2維生素在提取劑2中，基質(zhì)增強(qiáng)回收偏高，在剩余4種提取溶劑中回收率都很好。綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇20 mmol/L甲酸銨溶液作為提取溶劑。

圖2 不同提取劑對5種維生素回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recoveries of five vitamins

2.2.2 固相萃取柱的選擇

蜂蜜中含有大量的果糖和葡萄糖，如果不進(jìn)行凈化，很容易在離子源中碳化，出現(xiàn)離子傳輸管堵塞等問題，影響目標(biāo)物的離子化過程，降低其離子化效率，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。SPE柱因具有簡單、快速、高效等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多種食品基質(zhì)中目標(biāo)物凈化和富集。本實(shí)驗(yàn)考察了Waters Oasis HLB(200 mg,6 mL)、PRiME HLB(200 mg,6 mL)和C18(500 mg,6 mL)這3種固相萃取柱對5種維生素回收率的影響(見圖3)。結(jié)果表明維生素B1和泛酸在PRiME HLB的上樣和淋洗過程中損失太多，回收率偏低，不能滿足檢測需求。維生素B1和生物素在C18上回收率不足80%，泛酸和吡哆醇在HLB和C18回收率接近，維生素B2用C18凈化后回收率偏高，經(jīng)確認(rèn)是基質(zhì)增強(qiáng)明顯造成的。HLB固相萃取柱是在聚合物上鍵和官能團(tuán)，在去除糖類、蛋白等雜質(zhì)上有一定的優(yōu)勢，5種化合物均能得到很好地保留，回收率在85%以上，而C18柱是硅膠基體，不耐干涸，凈化過程需要更嚴(yán)格的控制，綜合考慮，本研究選擇HLB柱作為凈化柱。

圖3 不同固相萃取柱對5種維生素回收率的影響Fig.3 Effect of different solid phase extraction columns on recoveries of five vitamins

研究還對60、200和500 mg這3種規(guī)格型號的HLB柱對目標(biāo)物的回收率影響進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)60 mg填料太少，對目標(biāo)物保留弱，在上樣和淋洗過程中維生素B1、泛酸均有較大程度損失，維生素B1的回收率為36.7%，泛酸的回收率不足5%；200 mg和500 mg的2種填料的回收率幾乎無差異，基于經(jīng)濟(jì)考慮，本研究最終選擇Waters Oasis HLB(200 mg，6 mL)作為凈化柱。

2.2.3 上樣體積和洗脫液體積的優(yōu)化

確定固相萃取柱后，經(jīng)進(jìn)一步比較、優(yōu)化了上樣體積和洗脫用甲醇的體積對回收率和ME的影響。實(shí)驗(yàn)選取了0.5、1和2 mL這3個上樣體積進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上樣體積為2 mL時，泛酸ME明顯增強(qiáng)，上樣體積對其他目標(biāo)物影響不大，為保證目標(biāo)物的靈敏度，選擇上樣體積為1 mL。在上樣體積為1 mL 的條件下，分別采用0.5、1和2 mL甲醇對5種目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇含量為0.5 mL時目標(biāo)物回收率均低于50%；當(dāng)洗脫體積為1 mL和2 mL時，5種目標(biāo)物回收率無差異，洗脫液體積增加會延長氮吹時間，同時還可能將更多的雜質(zhì)一起洗脫下來，因此最終選擇1 mL甲醇進(jìn)行洗脫。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，獲得標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量色譜圖。以定量離子的峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。分別向蜂蜜樣品中加入10、20、50和100 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限為20 μg/kg，以信噪比S/N≥10確定方法的定量限為50 μg/kg。5種水溶性維生素的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、方法檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification，LOQ)見表3。在質(zhì)量濃度5～200 ng/mL范圍內(nèi)，定量離子的峰面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。洋槐蜜中5種維生素定量限水平的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖4所示。

表3 五種維生素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、 檢出限及定量限Table 3 Linear ranges, the linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of five vitamins

2.3.2 回收率與精密度

選擇5種維生素含量都較低的洋槐蜜作為空白樣品，向此樣品中添加低、中、高3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平做6個平行實(shí)驗(yàn)，測定5種維生素的回收率，考察方法的回收率和精密度(表4)。由表4可知，蜂蜜中5種維生素的加標(biāo)回收率在90.2%～108.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.49%～10.93%，方法的回收率和精密度滿足微量分析的要求。

表4 五種維生素的回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations of five vitamins in acacia honey(n=6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測過程中一般都存在一定的基質(zhì)效應(yīng)ME，常需要通過ME來評價方法的靈敏度和選擇性。取空白蜂蜜基質(zhì)樣品，按1.2的步驟制備空白基質(zhì)溶液。分別用基質(zhì)溶液和定容溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到同濃度水平的測定液。分別測定上述2種溶液中目標(biāo)成分的響應(yīng)值，計(jì)算兩者的相對比值來評價ME，如公式(1)所示：

(1)

ME絕對值越大基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。

蜂蜜中5種維生素的基質(zhì)效應(yīng)見圖5，結(jié)果表明，吡哆醇基本無基質(zhì)效應(yīng)，維生素B1、維生素B2、泛酸和生物素的ME的絕對值小于10%，滿足定量需求。因此，本方法采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線定量，減少了匹配相同空白基質(zhì)的難操作性及不同空白樣匹配帶來的差異性。

A-維生素B1；B-維生素B2;C-泛酸；D-吡哆醇；E-生物素圖4 洋槐蜜中5種維生素定量限水平的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram showing the LOQs for five vitamins spiked in acacia honey

圖5 蜂蜜中5種維生素基質(zhì)效應(yīng)評價圖Fig.5 Matrix effects in UPLC-MS/MS analysis of five vitamins in honey

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本研究建立的分析方法對蜂場采集的15批次蜂蜜樣品和網(wǎng)絡(luò)采購的15批次蜂蜜樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，30批次蜂蜜中維生素B1和生物素含量均低于定量限；維生素B2檢出率為10%，含量分別為74.6、80.7和315.8 μg/kg；2個網(wǎng)購的蜂蜜樣品中泛酸檢測值在檢出限和定量限之間，剩余28個樣品含量范圍是70.7～1 774.3 μg/kg；9個蜂蜜樣品中吡哆醇低于定量限，21個樣品蜂蜜中吡哆醇的含量范圍是58.3～658.4 μg/kg。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中5種水溶性維生素的分析方法。該方法以甲酸銨溶液作為提取溶劑，HLB固相萃取柱對目標(biāo)物進(jìn)行凈化，可明顯減少基質(zhì)影響；以HSS T3色譜柱進(jìn)行目標(biāo)物的分離，目標(biāo)物保留適中，峰形對稱；方法的回收率、精密度和靈敏度均能滿足各類檢測要求，可應(yīng)用于蜂蜜中5種水溶性維生素的同時檢測，大幅提高了檢測效率。