基于指紋圖譜和化學計量學的濃香型白酒分類研究

錢 宇，胡 雪，孫 躍，李錦松，黃志久，李 丹，張懷山，康峰豪，林 莉

（1.瀘州老窖集團有限責任公司，四川 瀘州 646000；2.四川輕化工大學 化學工程學院，四川 自貢 643000；3.四川大學 化工學院，四川 成都 610000；4.四川輕化工大學生物工程學院，四川 自貢 643000；5.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢 643000）

中國白酒是以糧谷為主要原料，用大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的，是世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的歷史，在國內外都享有盛譽[1]。白酒中的風味成分含量極低，僅占總質量的1%～2%[2]。目前，白酒中已知的風味化合物超過1 000種[3-4]。其中，超過60余種是白酒中的關鍵風味成分[5-6]，決定了白酒的香型、風格和品質。然而，由于地域、釀造工藝、原料、儲存環(huán)境等條件的不同，不同品牌的白酒在風味成分的種類和含量上存在差異。以往主要是依靠于品酒師的感官分析來對這些白酒進行區(qū)分，這種方式不僅需要長期積累經(jīng)驗，而且受人的情緒、身體條件等影響較大，不能保證結果的準確性和穩(wěn)定性。隨著經(jīng)濟的增長，白酒受到越來越多消費者的喜愛，一些不法商販假冒注冊商標，以次充好，欺騙消費者。為保證消費者和生產(chǎn)廠家的合法權益，對不同品牌的白酒進行鑒定變得十分重要。

目前，氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術已經(jīng)被廣泛地應用于茶葉[7]、蜂蜜[8-9]、食醋[10]、化妝品[11]等領域，主要對其香氣成分進行定性定量分析。同時，在白酒風味化合物的定性定量分析和白酒分類鑒別中[12-14]，GC-MS更是有巨大的潛力，這使得白酒質量、品牌、香型的鑒別結果更加準確[15-17]。然而，隨著檢測技術的發(fā)展，白酒中越來越多的化合物被檢測出來，通過化合物種類之間的差異對白酒進行區(qū)分的可能性不大，只有找出決定酒類差異的關鍵風味成分進行分析，并且結合不同品牌的白酒風味成分的差異和模式識別的方法對其進行區(qū)分才具有積極意義[18]。近年來，模式識別的優(yōu)點日益突出，已有許多研究學者將模式識別的方法用于茶葉[19]、酒類[20-22]等領域的研究，并且取得了一定成果。在各種分類鑒定的研究中，大多數(shù)學者選取的分類鑒定指標較多，這樣雖然能盡可能的將樣品間的差異包含進去，但也使實驗過程變得復雜[23-25]。

本研究以GC-MS技術快速測定的濃香型白酒風味成分為指標，結合相似度分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和判別分析（discriminant analysis，DA）對7個品牌共33個樣本進行區(qū)分鑒別，以期為更多白酒產(chǎn)品的區(qū)分鑒別提供新的方法，為不同品牌的濃香型白酒區(qū)分標準的建立提供理論依據(jù)和有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇7個品牌共33個濃香型白酒樣品為研究對象，每個品牌的白酒涵蓋了從中低端到高端不等價位，樣品信息見表1，所有酒樣均購于京東官方自營店。

表1 本研究所用濃香型白酒樣品信息Table 1 Information of strong-flavor Baijiu samples used in the study

C7～C40正構烷烴（均為色譜純）：北京曼哈格生物科技有限公司；無水乙醇（純度99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（純度99.9%）：上海阿達瑪斯試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ8000三重四極桿氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、AI1310多功能自動進樣器：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件優(yōu)化

為了獲得最佳的分離效果，同時節(jié)省分析時間，對氣相色譜條件進樣口溫度（220 ℃、230 ℃、250 ℃）、初始溫度（40 ℃、50℃、60 ℃）、40 ℃時的保留時間（0min、1 min、3 min）、40～120 ℃的升溫梯度（10 ℃/min、20 ℃/min、30 ℃/min）、120 ℃時的保留時間（0 min、3 min、5 min）、120～290 ℃的升溫梯度（10 ℃/min、20 ℃/min、30 ℃/min）、290 ℃時的保留時間（0 min、3 min、5 min）、分流比（40∶1、50∶1、60∶1）進行優(yōu)化，所有試驗的進樣量均為1 μL，色譜柱為HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

質譜條件：電離方式電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度為250 ℃；掃描方式為全掃描；掃描質量范圍為質核比（m/z）=30～550。

定性：將C7～C40的正構烷烴標準品和酒樣進行GC-MS分析，利用質譜數(shù)據(jù)庫美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）12進行檢索，計算的保留指數(shù)（retention index，RI）與文獻報道的保留指數(shù)進行對比綜合定性，其中保留指數(shù)的計算公示如下：

式中：RIx表示待測組分的保留指數(shù)；T（i）表示待測組分的保留時間，min；n和n+1分別表示正構烷烴的碳原子個數(shù)，個；T（n）和T（n+1）分別表示待測組分出峰前后相鄰的兩個正構烷烴的保留時間，min。

1.3.2 濃香型白酒中揮發(fā)性風味成分的檢測

采用1.3.1優(yōu)化后的GC-MS條件檢測濃香型白酒樣品中的揮發(fā)性風味成分。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用MicrosoftExcel，數(shù)據(jù)分析采用ChemPattern化學計量學軟件。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜條件優(yōu)化結果

通過1.3.1優(yōu)選出最佳的色譜條件：進樣口溫度250 ℃，升溫程序：初始溫度40 ℃，保留1 min，以10 ℃/min升高至120 ℃，再以20 ℃/min升高至290 ℃，保留5 min，分流比為50∶1。

2.2 濃香型白酒中揮發(fā)性風味物質的分析

以最優(yōu)的氣相色譜-質譜條件對濃香型白酒樣品WLY-1中的揮發(fā)性風味成分進行檢測分析，其風味成分的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 濃香型白酒樣品WLY-1中揮發(fā)性風味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatography of volatile flavor components in strong-flavor Baijiu sample WLY-1 analysis by GC-MS

由圖1可知，在15 min內能快速檢出112種風味成分，且以己酸乙酯為主，乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙縮醛、乙酸等為骨干成分。

2.3 方法學驗證

2.3.1 儀器精密度實驗

取同一批次濃香型白酒樣品1份，按照最優(yōu)的GC-MS條件連續(xù)測定5次，分別對化合物峰面積和相對保留時間進行統(tǒng)計。結果表明，總離子流色譜圖中各化合物的色譜峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）＜2%，相對保留時間的RSD＜0.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 方法重復性實驗

取同一批次濃香型白酒樣品6份，按照最優(yōu)的GC-MS條件進行測定，分別對化合物峰面積和相對保留時間進行統(tǒng)計。結果表明，總離子流色譜圖中各化合物色譜峰相對峰面積的RSD＜5%，相對保留時間的RSD＜0.1%，表明該實驗方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.3 樣品溶液穩(wěn)定性實驗

取同一批次濃香型白酒樣品1份，分別在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，按照最優(yōu)的GC-MS條件進行測定，分別對化合物的峰面積和相對保留時間進行測定，其中化合物峰面積的RSD＜3.5%，相對保留時間的RSD＜0.15%，表明酒樣在24 h內保持穩(wěn)定。

2.4 不同品牌濃香型白酒的指紋圖譜

本研究選取7個品牌共計33個濃香型白酒樣品，按照最優(yōu)的GC-MS條件對酒樣進行檢測，記錄下33個濃香型白酒樣品的總離子流色譜圖，見圖2。由圖2可知，同一品牌的酒樣中含量較高的風味成分差異不大，不同品牌酒樣中含量較高的化合物間的差異較明顯，如酒樣中含量較高的風味物質為乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯，在酒樣WLY中乳酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯含量明顯高于其他品牌。除此之外，一些含量稍低的風味成分在不同品牌的酒樣間也存在一定的差異。因此，利用濃香型白酒中的揮發(fā)性風味成分的總離子流色譜圖進行分類具有一定的可行性。

圖2 33個濃香型白酒樣品中揮發(fā)性風味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatography of volatile flavor components in 33 strong-flavor Baijiu samples analysis by GC-MS

2.5 指紋圖譜共有模式的建立和相似度評價

將33個酒樣的GC-MS總離子流色譜圖導入ChemPattern軟件中，以色譜峰面積歸一化后相對峰面積＞0.5%為限定值挑選用于相似度分析的風味化合物，篩選結果見表2。由表2可知，共篩選得到31種共有化合物，酯類14種，醇類8種，醛酮類6種，酸類2種，烷烴類1種。利用夾角余弦算法計算樣品間的相似程度。相似度分析結果顯示，酒樣相似度在0.65～0.95之間，表明同為濃香型白酒，不同品牌間樣品的骨架風味成分存在顯著差異。同時根據(jù)相似度聚類結果來看，相同品牌不同等級的酒樣骨架風味成分具有很高的相似性。

表2 33個濃香型白酒樣品中的共有化合物信息Table 2 Information of common compounds in 33 strong-flavor Baijiu samples

2.6 主成分分析

基于共有化合物的峰強度對所有樣品進行主成分分析，相關矩陣的特征值見表3。由表3可知，第一主成分（principal component 1，PC1）的方差貢獻率為57.74%，第二主成分（PC2）的方差貢獻率為18.44%，第三主成分（PC3）的方差貢獻率為13.53%，前三個主成分累計方差貢獻率達到89.71%，基本保留了酒樣原來變量的信息。因此，取前三個主成分作為該研究的主要成分進行不同品牌濃香型白酒的區(qū)分是可行的。

表3 33個濃香型白酒的主成分分析特征值和總體方差描述Table 3 Principal component analysis characteristics and total variance description of 33 strong-flavor Baijiu samples

以PC1、PC2、PC3為坐標軸建立每個濃香型白酒樣本的三維得分圖，見圖3。由圖3可知，7個不同品牌的濃香型白酒的區(qū)分度較高，其中五糧液（WLY）、今世緣（JSY）、迎駕貢酒（YJGJ）、水井坊（SJF）、豐谷（FG）、瀘州老窖（LZLJ）的酒樣都能進行有效地分離。由于詩仙太白（SXTB）的酒樣分布較分散，與瀘州老窖的酒存在部分的交叉，因此，區(qū)分效果較其他品牌稍差。

圖3 33個濃香型白酒主成分分析得分圖Fig.3 Score of principal component analysis of 33 strong-flavor Baijiu samples

2.7 判別分析

經(jīng)過判別分析，取得了5個典型判別函數(shù)，其特征值分別為95.46、5.67、4.69、1.18、0.19，分別能夠解釋模型方差變化的89.01%、5.28%、4.43%、1.12%、0.16%。其中前兩個典型判別分析函數(shù)可解釋94.29%的方差變化，包含了樣品的主要信息，可以描述7個不同品牌的濃香型白酒中風味成分的差異與聯(lián)系。用前兩個典型判別函數(shù)對各個酒樣做散點圖，結果見圖4。由圖4可知，迎駕貢酒（YJGJ）、水井坊（SJF）和豐谷（FG）這三個品牌酒樣的組質心距離相對較近，較為相似，但都相互分離，沒有重疊，其余4個品牌的組質心距離較遠，說明他們差異較大?？偟膩碚f，7個品牌的組質心都相互分離，沒有出現(xiàn)重疊的現(xiàn)象。這個結果與主成分分析的結果基本一致，表明了對于不同品牌濃香型白酒的分類，主成分分析和判別分析都是很有效的工具，對于不同品牌的濃香型白酒的分類和預測具有一定的指導意義。

圖4 典型判別分析散點圖Fig.4 Scatter plots of canonical discriminant analysis

對7個品牌的33個濃香型白酒樣品進行判別分析。分別從各個品牌中隨機抽出一個樣本作為“測試樣本”，共計7個，以剩下的26個樣本為“訓練樣本”建立判別函數(shù)，然后對測試樣本進行判別，確定其品牌，并與樣本實際品牌對比。在本次研究中，獲得7個典型變量，依據(jù)這些變量建立一個判別函數(shù)來實現(xiàn)不同品牌的濃香型白酒的分類，準確的區(qū)分率為100.0%，鑒定分類結果見表4。

表4 濃香型白酒典型判別分析預測結果Table 4 Prediction results of canonical discriminant analysis of strong-flavor Baijiu samples

由表4可知，濃香型白酒的GC-MS分析總離子流色譜圖結合判別分析可用于不同品牌的濃香型白酒的鑒別模型的建立，7個樣品的鑒別正確率為100.0%。結果表明，指紋圖譜可用于不同品牌的濃香型白酒的區(qū)分。

3 結論

本研究采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對7個品牌的33個濃香型白酒樣品進行了指紋圖譜分析，并結合多種化學計量學方法進行鑒定。結果表明，相似度分析中，酒樣的相似度區(qū)在0.65～0.95，說明不同品牌酒樣中的風味成分基本相同，但在含量上具有一定的差異；主成分分析中前3個主成分累計方差貢獻率為89.71%，三維主成分散點圖表明其對不同白酒的區(qū)分較好，具有一定的可行性。判別分析中前兩個主成分能夠解釋模型的94.29%方差變化，分類結果表明對不同品牌的判定結果的正確率為100%，前2個判別函數(shù)的二維散點圖顯示區(qū)分效果顯著，極大地提高了分類正確率，準確率高達100%；可見，氣相色譜-質譜聯(lián)用儀結合多種化學計量學的方法可用于不同品牌濃香型白酒的區(qū)分。