芒果蘋果復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及成分含量測(cè)定

尚遠(yuǎn)宏，田金鳳

（攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

芒果（Mangifera indicaLinn.），漆樹科芒果屬的多年生植物[1]，芒果果實(shí)為熱帶躍變型果實(shí)[2]，其營養(yǎng)豐富[3]，果肉含糖量為9.5%～20.9%，總酸量為0.1%～0.64%[3-4]，其中芒果苷在不同品種、不同成熟度的果肉中的含量不盡相同[5]，但為芒果的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用。目前，攀枝花的凱特芒果種植最多，占芒果種植總面積接近70%[6]，產(chǎn)量約為20多萬t，但由于芒果具有明顯的季節(jié)性特征[7]和不易保藏，以及果農(nóng)盲目跟種而導(dǎo)致種植面積擴(kuò)大，又無規(guī)模化的芒果加工，出現(xiàn)了鮮果供過于求的現(xiàn)象，影響種植戶增收[8]。蘋果（Malus domesticaBorkh.）屬于薔薇科蘋果亞科的蘋果屬，是栽培種類的統(tǒng)稱[9]，其富含維生素C（vitamin，VC）、多酚、膳食纖維、可溶性糖、果膠、類黃酮類化合物、有機(jī)酸、礦物質(zhì)和微量元素等[10-11]。目前，金冠蘋果種植面積是鹽源縣蘋果種植總面積接近60%以上[12]，產(chǎn)量近30萬t，成熟期過于集中，冷鏈貯運(yùn)、果品產(chǎn)后處理和市場(chǎng)培育嚴(yán)重滯后，加工專用型品種處于空白，制約了蘋果產(chǎn)業(yè)效益的發(fā)揮和提高[12-13]。

芒果發(fā)酵酒[14-17]和蘋果發(fā)酵酒[18-19]的研究報(bào)道眾多，但是芒果蘋果復(fù)合果酒的研發(fā)卻鮮有報(bào)道。攀枝花芒果和鹽源蘋果資源豐富，營養(yǎng)價(jià)值較高，酸甜適口，香氣濃郁，適合用作原料加工成果酒，既可以延長貨架期，又可以提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，本研究以凱特芒果和金冠蘋果作為原料，研制芒果蘋果復(fù)合果酒，采用單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并測(cè)定復(fù)合果酒中的芒果苷含量，使果酒工藝可行可控，為果酒實(shí)際生產(chǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，芒果和蘋果復(fù)合果酒的研制，對(duì)解決攀枝花芒果和鹽源蘋果的銷售問題提供了思路，有較好的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠酶（酶活10 000 U/g）、纖維素酶（酶活10 000 U/g）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；檸檬酸（分析純）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：中國食品藥品檢定研究院；安琪專用葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；攀枝花凱特芒果、鹽源金冠蘋果、白砂糖：市售；甲醇（色譜級(jí)）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國安捷倫公司；BDV-325414167電子天平：捷久計(jì)量衡器（上海）有限公司；A115038糖度計(jì)：上海邦西儀器科技有限公司；PHS-550數(shù)顯酸度計(jì)：杭州陸恒生物科技有限公司；ZTS-1P烘箱：昆山臺(tái)順測(cè)試科技有限公司；0.1分度酒精計(jì)：武強(qiáng)縣精創(chuàng)儀器儀表廠；LRH-250-2振蕩培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；KH5200E超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；ZDHW數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果蘋果復(fù)合果酒的工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：篩選成熟度好的蘋果和芒果，清洗，瀝干，待用。芒果去皮去核后榨汁，加入纖維素酶（0.4 g/L）和果膠酶（4 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃滅酶3 min[8]，冷卻至室溫，過濾后得到芒果原汁。去核后的蘋果榨汁，添加果膠酶（5 g/L）和纖維素酶（0.3 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃滅酶3 min，冷卻至室溫，過濾后得到蘋果原汁。量取200 mL混合果汁（芒果汁與蘋果汁體積比為75∶25）和水50 mL，用適量白砂糖調(diào)整初始糖度為18%，檸檬酸調(diào)整pH值為3.7，偏重亞硫酸鉀加入量為50 mg/L，其可以起到殺菌和提高穩(wěn)定性[20]。在無菌條件下，混合果汁以活化后的0.10%酵母菌接種（安琪酵母水溶液置于35 ℃的恒溫水浴活化60 min，待觀察其產(chǎn)氣泡豐富時(shí)，即可作為活化菌種使用），并在27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 d后，虹吸上層酒液保存于無菌容器中，并冷藏靜置1 d，過濾，巴氏殺菌（65 ℃、30 min）[21]，即得芒果蘋果復(fù)合果酒。

1.3.2 芒果蘋果復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：選取芒果汁和蘋果汁的體積比分別為（10∶90、25∶75、50∶50、75∶25、90∶10）、安琪酵母添加量分別為（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發(fā)酵溫度分別為（23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃、31 ℃）、初始糖度分別為（14%、16%、18%、20%、22%）、初始pH值分別為（3.1、3.3、3.5、3.7、3.9）進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)，以酒精度及感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定各因素對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒品質(zhì)的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇混合果汁初始pH值為3.7、活化酵母添加量為0.10%和發(fā)酵時(shí)間為10 d，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)芒果汁和蘋果汁體積比（A）、初始糖度（B）及發(fā)酵溫度（C）3個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation process optimization

1.3.4 感官評(píng)分

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行感官評(píng)分[22]，選10名食品專業(yè)人員，分別對(duì)芒果蘋果果酒產(chǎn)品的色澤、香氣、澄清度、滋味、典型性進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分，具體感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[23]。

1.3.5 理化指標(biāo)檢測(cè)方法

酒精度：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的酒精計(jì)法測(cè)定[24]；糖度：糖度計(jì)測(cè)定；酸度：酸度儀測(cè)定；總糖（以葡萄糖計(jì)）：直接滴定法測(cè)定[22]。

1.3.6 高效液相色譜法測(cè)定果酒中芒果苷含量

高效液相色譜條件：Agilent C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（28∶72，V/V）[25]，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為258 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

對(duì)照品溶液制備：精密稱取17.40 mg的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為40%甲醇至刻度，搖勻，即得0.696 mg/mL芒果苷對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，芒果苷質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取500 mL發(fā)酵完成的果酒，在80 ℃以內(nèi)加熱濃縮至50 mL，取濃縮后25 mL的果酒置于100 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為40%甲醇至刻度，超聲30 min，微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取濾液作供試品溶液。按照上述色譜條件，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中芒果苷含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)為重復(fù)3次試驗(yàn)的平均值，采用Origin 7.5作圖和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 酵母添加量對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度和感官評(píng)分先升高后下降，且在接種量為0.10%時(shí)，芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分均為最大值，分別為（11.7±0.2）%vol和（84.5±0.4）分，但再繼續(xù)增加酵母接種量，出現(xiàn)果漿中糖分過多而促進(jìn)了酵母菌的生長繁殖，反而不利于發(fā)酵，酒精度隨之下降，且不利于酒精和香氣物質(zhì)的形成，口感變差。因此，選擇0.10%作為酵母最適添加量。

圖1 酵母添加量對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.2 初始糖度對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，當(dāng)初始糖度為14%～16%時(shí)，由于糖度不足，使芒果蘋果酒中酒精度較低，發(fā)酵果酒風(fēng)味不佳，感官評(píng)分較低；當(dāng)初始糖度達(dá)到18%時(shí)，酒樣感官評(píng)分（最高）為（83.6±0.5）分，酒精度為（11.1±0.1）%vol，果酒風(fēng)味較好，說明該糖度比較適宜果酒發(fā)酵；在初始糖度＞18%時(shí)，糖度過高，果酒黏度增加，影響感官評(píng)價(jià)。因此，選擇18%作為最適初始糖度。

圖2 初始糖度對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，感官評(píng)分和酒精度隨發(fā)酵溫度的升高先升高后降低，同時(shí)在溫度為27 ℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為（84.1±0.4）分和（11.6±0.2）%vol，而后隨發(fā)酵溫度升高，酵母衰老加速（活性受到抑制）使酒精度下降，影響口感，導(dǎo)致感官評(píng)分下降。因此，選擇27 ℃作為最適發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.4 芒果汁和蘋果汁體積比對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，不同芒果汁和蘋果汁體積比（10∶90、25∶75、50∶50、75∶25、90∶10）條件下，芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度在11.5%vol～11.7%vol范圍內(nèi)基本不變。當(dāng)芒果汁和蘋果汁體積比為10：90時(shí)，芒果蘋果復(fù)合果酒感官評(píng)分較低，為（73.8±0.3）分，口感風(fēng)味較差。當(dāng)芒果汁和蘋果汁體積比為75∶25時(shí)，發(fā)酵生產(chǎn)的復(fù)合果酒感官評(píng)分最高，為（84.1±0.3）分，酒精度適宜，為（11.6±0.1）%vol；而隨著芒果汁和蘋果汁體積比繼續(xù)升高時(shí)，復(fù)合果酒感官評(píng)分降低。因此，選擇芒果汁和蘋果汁最適體積比為75∶25。

圖4 芒果汁和蘋果汁體積比對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of volume ratio of mango juice and apple juice on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.5 初始pH值對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著初始pH值的增大，酒精度和感官評(píng)分均先升高后下降，當(dāng)pH值為3.1～3.5時(shí)，果酒酒精度較低，感官評(píng)分低，口感風(fēng)味較差，說明pH值過低導(dǎo)致酵母的生長受到了抑制，發(fā)酵速度慢，不利于果酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。在pH值為3.7時(shí)，芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為（11.4±0.2）%vol和（83.9±0.3）分，說明此pH值下發(fā)酵的果酒風(fēng)味較好。當(dāng)pH值為3.9時(shí)，酒精度和感官評(píng)分均降低，說明pH值過高，可能出現(xiàn)雜菌生長較快，影響酵母的正常生長代謝和口感評(píng)價(jià)。因此，選擇最適初始pH值為3.7。

圖5 初始pH值對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of initial pH value on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定混合果汁初始pH值為3.7、活化酵母添加量為0.10%和發(fā)酵時(shí)間為10 d，以芒果汁和蘋果汁體積比（A）、初始糖度（B）及發(fā)酵溫度（C）為主要影響因素，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation process optimization

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用分析軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，得酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

由表3可知，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化建立的芒果蘋果發(fā)酵工藝回歸方程（模型），其2個(gè)模型均極顯著（P＜0.01），且失擬項(xiàng)均不顯著（P＞0.05），且酒精度校正系數(shù)R2adj為97.59%和感官評(píng)分的校正決定系數(shù)R2adj為99.62%，表明模型是可靠的且擬合程度較好。以酒精度為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），且F檢驗(yàn)可得因子貢獻(xiàn)率為C＞A＞B；以感官評(píng)分為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)B、C影響顯著（P＞0.05），一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），且F檢驗(yàn)可得因子貢獻(xiàn)率為A＞C＞B。各因素對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見圖6。由圖6可知，在Y1模型中BC、AB交互作用不顯著（P＞0.05），AC顯著（P＜0.05）；而Y2模型中AC、BC、AB交互作用均不顯著（P＞0.05），各因素對(duì)酒精度和感官評(píng)分的影響不顯著，應(yīng)用該模型時(shí)可以不考慮因素間的交互作用。但應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析時(shí)，選擇酒精度和感官評(píng)分的重要性均為5，分別選擇酒精度和感官評(píng)分的最大響應(yīng)值，可得最優(yōu)響應(yīng)面分析結(jié)果∶芒果汁和蘋果汁體積比74.02∶25.98，初始糖度為17.92%，發(fā)酵溫度為27.34 ℃，并由此條件下發(fā)酵后芒果蘋果復(fù)合果酒酒精度理論值為11.13%vol，感官評(píng)分理論值為84.1分?？紤]實(shí)際的操作情況，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為芒果汁和蘋果汁體積比為74∶26，初始糖度為18%，發(fā)酵溫度為27 ℃，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，芒果蘋果復(fù)合果酒的感官評(píng)分實(shí)際值為84分，酒精度實(shí)際值為11%vol，結(jié)果與預(yù)測(cè)值相差微小，說明回歸模型可靠，用響應(yīng)面優(yōu)化芒果蘋果復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝可行。

圖6 初始糖度、芒果汁和蘋果汁體積比及發(fā)酵溫度交互作用對(duì)芒果蘋果復(fù)合果酒感官評(píng)分和酒精度影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between initial sugar,volume ratio of mango juice and apple juice and fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.3 復(fù)合果酒中芒果苷含量的測(cè)定

以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，芒果苷質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，芒果苷對(duì)照品及樣品HPLC檢測(cè)結(jié)果見圖7。

圖7 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線（a）,對(duì)照品（b）及樣品（c）高效液相色譜分析Fig.7 Standard curve (a),standard (b) and the sample (c) of mangiferin analysis by HPLC

由圖7a可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2 937.1X+575.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，芒果苷對(duì)照品在0.696～3.480 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。由圖7b和7c可知，最佳優(yōu)化發(fā)酵工藝條件得到復(fù)合果酒樣品中芒果苷含量為0.103 6 mg/mL。

3 結(jié)論

以攀枝花凱特芒果和鹽源金冠蘋果為原料，通過單因素試驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化芒果蘋果復(fù)合果酒釀造工藝參數(shù)，得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為芒果汁和蘋果汁體積比為74∶26，初始糖度為18%，發(fā)酵溫度為27 ℃。在此發(fā)酵工藝條件下，得到芒果蘋果復(fù)合果酒的感官評(píng)分為84分，酒精度為11%vol，果酒中芒果苷平均含量為0.103 6 mg/mL，其芒果蘋果復(fù)合酒呈棕黃色，酒體澄清透明，酒香濃郁，口感柔和。本研究得到的芒果蘋果復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件，可為今后水果果酒生產(chǎn)化提供一定參考意義。