響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果酒發(fā)酵工藝研究

王 宏，李 登，黃星源，劉功良 *，白衛(wèi)東，曾 彬

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東星耀生物科技有限公司，廣東 郁南 527100；3.天地壹號飲料股份有限公司，廣東 江門 529000）

刺梨（Rosa roxburghii）是薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實，生長在海拔500 m到2 500 m的地區(qū)，分布于陜西、甘肅及西南等地區(qū)，其中貴州所產(chǎn)刺梨最為出名[1]。刺梨果肉爽脆，成熟后的刺梨肉質(zhì)肥厚、味酸甜。刺梨富含維生素C、超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、胡蘿卜素、有機(jī)酸等十多種人體所需的微量元素[2]。此外，刺梨果實中還含有很多重要生物活性成分，目前從刺梨中分離得到的活性物質(zhì)包括：原兒茶酸、刺梨酸、刺梨苷等，分別是黃酮類、有機(jī)酸、三萜類化合物[3-4]。

刺梨清甜爽口，具有獨特的香氣，同時還富含多種人體所需營養(yǎng)成分，具有延緩衰老[5]、提高機(jī)體免疫作用[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、預(yù)防癌癥[9]、解毒[10]等多種功效，因此，對刺梨進(jìn)行研究與利用具有廣闊的市場需求和前景。刺梨除了鮮食之外，還能曬干泡水，加工成方便食用與存放的相關(guān)產(chǎn)品。其中果酒不僅能夠保留果實中原有的營養(yǎng)物質(zhì)，相比蒸餾酒具有更加高的營養(yǎng)價值，而且具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)微循環(huán)等生理保健作用[11]。韋唯等[12-15]比較了刺梨鮮果、無籽刺梨和金刺梨不同加工方式對果酒品質(zhì)及其相關(guān)成分的影響，為刺梨果果實深加工開發(fā)提供了新思路。

由于刺梨果實的收獲期不足30 d，鮮果供應(yīng)期短，會在一定程度上限制刺梨果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及市場的擴(kuò)大。刺梨加工成刺梨果干后更有利于貯藏及運輸。本研究探討了初始糖含量、酵母接種量及發(fā)酵時間對刺梨果酒品質(zhì)的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了刺梨果酒發(fā)酵工藝，以期為刺梨果酒生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果干：成都暖民投資管理有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（食品級，酶活力30 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；纖維素酶（食品級，酶活力10 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH4電熱恒溫水浴鍋：邦西儀器科技有限公司；BL-600電子天平：廣州市正一有限公司；DHP-9172電熱恒溫培養(yǎng)箱：廣州康恒儀器有限公司；6202高速粉碎機(jī)：常州澳華儀器有限公司；722可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨果酒發(fā)酵工藝流程刺梨果干→粉碎→酶解→過濾→糖酸調(diào)整→接種→發(fā)酵→過濾→殺菌→果酒樣品

1.3.2 主要操作要點

（1）粉碎：將刺梨果干置于高速粉碎機(jī)中粉碎，備用。

（2）酶解：向刺梨果粉中加入適量無菌水，攪拌均勻。為加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸，再加入0.05%的果膠酶與0.1%纖維素酶，50 ℃酶解40 min[16-17]，過濾。

（3）糖酸調(diào)整：向果汁中加入適量白砂糖，并調(diào)整pH為4.0[18-19]。

（4）接種：稱取適量的安琪活性干酵母BV818，加入10倍含4%葡萄糖的無菌水溶液中，混勻，于35 ℃保溫20～30 min，期間每10 min振蕩一次，至產(chǎn)生大量氣泡即可[20]。

（6）發(fā)酵：接入適量的擴(kuò)大培養(yǎng)后的酵母菌，蓋上6層紗布于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酒精發(fā)酵，待酒液上泡沫下降（約1.5 d）即可換上玻璃塞，進(jìn)行發(fā)酵。

（7）殺菌：將樣品置于70 ℃加熱20 min[21]。

1.3.3 刺梨果酒感官評價分析

根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]中有關(guān)葡萄酒、果酒的感官評價標(biāo)準(zhǔn)以及其他研究中對刺梨果酒或其他果酒[23]的感官描述，對刺梨果酒的色澤、外觀、香氣、滋味及典型性各項影響的大小，從而得出刺梨果酒感官評價表如表1，滿分100分。選取具有一定果酒品嘗能力的10人，通過感官評價對刺梨果酒各項進(jìn)行評分。

表1 刺梨果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of Rosa roxburghii fruit wine

續(xù)表

1.3.4 刺梨果酒酒精度的測定

根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的酒精計法測定[22]。

1.3.5 刺梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

采用刺梨果粉添加量為7.5%制得刺梨果汁，分別考察不同初始糖含量（200 g/L、240 g/L、280 g/L、320 g/L、360 g/L）、酵母接種量（4%、5%、6%、7%、8%）、發(fā)酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對發(fā)酵果酒感官評價及酒精度的影響。

1.3.6 刺梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，以初始糖含量（A）、酵母添加量（B）、發(fā)酵時間（C）為評價因素，以感官評分（Y）作為響應(yīng)值，通過建立回歸方程預(yù)測響應(yīng)值最大時確認(rèn)刺梨果酒的釀造工藝，響應(yīng)面試驗因素與水平見表2。

表2 刺梨果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for Rosa roxburghii fruit wine fermentation conditions optimization

1.3.7 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及其顯著性差異分析采用Design-Expert 8.0.6軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 初始糖含量對刺梨果酒品質(zhì)的影響

如圖1所示，隨著初始糖含量增加，刺梨果酒逐漸澄清，酒香逐漸濃郁，口感越來越甜。從感官評價這一指標(biāo)來看，初始糖含量在240 g/L時，分值達(dá)到最高。隨著發(fā)酵初始糖含量增大，酒精度逐漸增大。初始糖度對刺梨果酒酒精度和感官評價影響的變化趨勢同柚子果酒工藝報道類似[24]。同時，當(dāng)發(fā)酵初始糖含量較高時，發(fā)酵液的滲透壓增大，抑制酵母菌的生長繁殖。酵母菌的生長適應(yīng)期延長時，對刺梨果酒的酒精發(fā)酵而言是不利的，酒精度難以上升。而且初始糖含量太高意味著調(diào)整糖度時所添加的白砂糖量增多，發(fā)酵后酒的果香也會受到影響，同時果酒太甜也會影響刺梨果酒的口感及風(fēng)味。綜上，刺梨果酒的發(fā)酵初始糖含量應(yīng)該選擇在240 g/L左右。

圖1 初始糖含量對刺梨果酒感官評分和酒精度的影響Fig.1 Effect of initial sugar concentration on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine

2.1.2 酵母接種量對刺梨果酒品質(zhì)的影響

如圖2所示，酒精度總體上隨著酵母接種量的增加而緩慢上升。酵母菌含量增加，其生長繁殖速度加快，無氧呼吸產(chǎn)物酒精增多，消耗的糖也增多。當(dāng)酵母接種量過多時，發(fā)酵果汁中的酵母菌濃度高，酵母數(shù)量不斷增加，酵母菌所產(chǎn)生的代謝廢物也所增加，此時酵母活性降低，影響果酒質(zhì)量。同時刺梨果酒隨著酵母接種量的增加，果酒的色澤由黃棕色逐漸變淺，但沉淀及懸浮物逐漸增多，酒香雖逐漸增加，但“酵母味”也相應(yīng)增加[25]，刺梨原有的果香味逐漸被掩蓋。果酒口感略微下降，苦澀味變重，感官評價得分呈下降趨勢。優(yōu)先考慮到刺梨果酒感官評分結(jié)果，因此酵母接種量選擇在4%左右。

圖2 酵母接種量對刺梨果酒感官評分和酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine

2.1.3 發(fā)酵時間對刺梨果酒品質(zhì)的影響

如圖3所示，發(fā)酵時間延長，刺梨果酒酒精度不斷增加。當(dāng)發(fā)酵時間＜7 d時，刺梨果酒隨著發(fā)酵時間的延長，口感愈加醇厚、細(xì)膩，酒香愈加濃郁、醇和，果酒獨特的風(fēng)味更加協(xié)調(diào)、酸甜適中，感官評分隨發(fā)酵時間的增加不斷升高。當(dāng)發(fā)酵時間為7 d時，刺梨果酒的感官指標(biāo)均處于較高水平。發(fā)酵時間＞7 d之后，刺梨果酒酒體逐漸渾濁，酒味變重，與刺梨果香的香氣不夠協(xié)調(diào)，且果酒苦澀味增加，感官評分有所回降，這與之前關(guān)于無花果山楂復(fù)合果酒的釀造工藝報道的趨勢類似[26]。由于發(fā)酵時間變長，酵母生長旺盛，代謝能力增強(qiáng)，殘?zhí)沁M(jìn)一步減少，酒精度漸漸增加，而總酸的含量可能升高，因而影響果酒的口感、風(fēng)味，使得刺梨果酒酸甜不夠協(xié)調(diào)。綜上，刺梨果酒的發(fā)酵時間應(yīng)該選在7 d。

圖3 發(fā)酵時間對刺梨果酒感官評分和酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件將上述3個因素分析后，設(shè)計出17組試驗方案，根據(jù)軟件給出的試驗順序進(jìn)行試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 刺梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Rosa roxburghii fruit wine

續(xù)表

利用Design-Expert 8.0.6軟件，對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得感官評價對初始糖含量、酵母接種量、發(fā)酵時間的二次多項回歸方程：

2.2.2 方差分析

方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，模型P=0.0014（P＜0.01），說明模型顯著；失擬項P=0.083 7（P＞0.05），不顯著。對模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗，一次項A（初始糖含量）及二次項A2、B2對刺梨果酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01），其余因素對刺梨果酒感官評價影響不顯著（P＞0.05）。各因子對刺梨果酒感官評分的影響依次是A（初始糖含量）＞C（發(fā)酵時間）＞B（酵母接種量）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.3 因素間交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面及其等高線圖可評價試驗因素之間的相互作用及其對感官評價的影響，以確定各因素的最佳水平范圍，繪制各因素交互作用對結(jié)果影響的響應(yīng)面和等高線見圖4。響應(yīng)面等高線的形狀反映了兩因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形說明兩因素交互作用顯著，圓形則說明兩因素交互作用不顯著。從響應(yīng)面圖中可直觀看出因素對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖及方差分析表明，3個因素對刺梨果酒感官評價的影響大小為初始糖含量＞發(fā)酵時間＞酵母接種量。

圖4 初始糖含量、酵母添加量及發(fā)酵時間交互作用對刺梨果酒感官評價影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar concertation,yeast inoculum and fermentation time on sensory evaluation of Rosa roxburghii fruit wine

圖4（a）顯示了初始糖含量和酵母接種量的交互作用，當(dāng)初始糖含量一定時，隨著酵母添加量的增加，感官評分含量先增加后減少。圖4（b）顯示了初始糖含量和發(fā)酵時間的交互作用，發(fā)酵時間較少時，初始糖濃度增加，感官評分也隨之增加；發(fā)酵時間較長時，初始糖含量增加，感官評分先增加后減少。初始糖含量一定時，感官評分隨著發(fā)酵時間的增加而增加。圖4（c）顯示了酵母添加量和發(fā)酵時間的交互作用。通過對回歸模型方程求解，得出刺梨果酒的前發(fā)酵釀造工藝為初始糖含量270.69 g/L，酵母接種量4.43%，發(fā)酵時間8 d，在此條件下響應(yīng)值最大為83.52分。

2.2.4 回歸模型的驗證

通過該回歸方程得到優(yōu)化后的工藝參數(shù)，即初始糖含量270.69 g/L，酵母接種量4.43%，發(fā)酵時間8 d。為驗證模型的可預(yù)測性，同時考慮到實際操作中的可行性，將工藝條件調(diào)整為：初始糖含量270 g/L，酵母接種量4.5%，發(fā)酵時間8 d，在此條件下對刺梨果酒前發(fā)酵工藝條件進(jìn)行驗證。結(jié)果得出其感官評價得分為83分，酒精度為12%vol，與預(yù)測值較為相近，因此運用響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果酒釀造工藝的回歸模型可行。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析試驗結(jié)果表明刺梨果酒前發(fā)酵工藝條件為初始糖含量270 g/L，酵母接種量4.5%，發(fā)酵時間8 d。在此條件下釀造的刺梨果酒感官評分最高為83分，苦澀味明顯減輕，酒體色澤呈淺棕色，澄清透亮，酒香協(xié)調(diào)無異味，酸甜適中，酒精度為12%vol。