海洋微生物來源木聚糖酶研究進展

田艷杰，徐 佳，賈騰飛，馬苗苗，張慧姍，王 燕，周晨妍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南省合成生物學(xué)工程實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

木聚糖具有多個不同的取代基，是一種結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜、分化度很高的多聚五碳糖，主要存在于植物細胞的細胞壁中，是植物細胞半纖維素的重要組成成分[1]。木聚糖的生物降解需要多種酶的協(xié)同作用，這些能降解木聚糖的水解酶統(tǒng)稱為木聚糖酶。木聚糖酶有一個復(fù)雜的酶系統(tǒng)[2]，其中最關(guān)鍵的一類木聚糖酶為β-1,4-內(nèi)切-D-木聚糖酶（endoβ-1,4-D-xylanase）[EC3.2.1.8]，該木聚糖酶能降解木聚糖的主鏈結(jié)構(gòu)[3-4]。

木聚糖酶來源廣泛，包括陸地植物組織、細菌、真菌和原生動物等，但大部分來源于陸地。海洋中物種豐富，種類繁多，是人們賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。海洋微生物產(chǎn)生的木聚糖酶與陸地微生物產(chǎn)生的酶相比具有其特殊性，這些特性使得海洋酶在基礎(chǔ)研究和工業(yè)應(yīng)用等方面具有巨大價值，近些年對海洋微生物木聚糖酶的研究成為現(xiàn)在微生物木聚糖酶研究的熱點。

1 產(chǎn)木聚糖酶海洋微生物

目前，海洋木聚糖酶主要從細菌[7-8]、真菌[9]以及放線菌[10-11]中分離得到，且細菌產(chǎn)木聚糖酶通常是首選。

海洋來源的木聚糖酶具有嗜鹽、嗜熱、厭氧等特殊性。從海洋細菌中獲得的木聚糖酶大多數(shù)為β-1,4-內(nèi)切-D-木聚糖酶，這些木聚糖酶大多數(shù)屬于糖苷水解酶家族10和11，但也有屬于糖苷水解酶（glucoside hydrolase，GH）家族8、26和30，分子質(zhì)量大多數(shù)在22～50 kDa。最近報道的產(chǎn)木聚糖酶的海洋細菌、木聚糖酶基因、GH家族及分子質(zhì)量見表1。

表1 產(chǎn)木聚糖酶的海洋細菌Table 1 Xylanase-producing marine bacteria

木聚糖酶可由多種微生物產(chǎn)生，海洋真菌是木聚糖酶的重要來源，但目前對海洋真菌來源的木聚糖酶的研究相對于海洋細菌較少，對其來源的木聚糖酶基因研究尚不清楚。目前，經(jīng)過篩選已經(jīng)獲得了幾種能產(chǎn)生木聚糖酶的海洋真菌見表2。

表2 產(chǎn)木聚糖酶的海洋真菌Table 2 Xylanase-producing marine fungi

許多海洋放線菌除了產(chǎn)生負責(zé)天然產(chǎn)物生物合成的獨特酶外，還產(chǎn)生能夠降解各種生物聚合物（如木聚糖、纖維素和甲殼素）的水解酶。產(chǎn)木聚糖酶的海洋放線菌見表3。

表3 產(chǎn)木聚糖酶的海洋放線菌Table 3 Xylanase-producing marine actinomycetes

2 產(chǎn)木聚糖酶菌株的選育

海洋微生物的基因組資源特異性豐富，通過對海洋微生物來源的菌株選育，能夠篩選出具有特異性的產(chǎn)木聚糖酶的海洋菌株，對這些菌株的基因序列和功能進行分析和鑒定，能夠得到嗜鹽、嗜熱、厭氧等不同功能的木聚糖酶基因。如黃小云等[39]在多種海洋來源的樣品中篩選出了38株具有產(chǎn)木聚糖酶能力的菌株，其中菌株B659產(chǎn)酶能力最高，酶活力為525.3 U/mL；YOPI Y等[20]從20株海洋芽孢桿菌分離株中分離、鑒定得到產(chǎn)甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶的海洋芽孢桿菌菌株，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；HOU Y H等[26]從黃海沉積物中分離到1株冷適應(yīng)青霉菌（Penicillium）FS010，并從該菌中獲得冷活性木聚糖酶XYL。

3 木聚糖酶基因的克隆及分子改造

產(chǎn)木聚糖酶菌株篩選的環(huán)境不同，獲得的菌株生長條件及產(chǎn)酶活力也存在很大差異。對菌株進行基因克隆與改造，能優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件，提高其產(chǎn)酶能力。GUO B等[16]從嗜中穩(wěn)居水菌（Glaciecola mesophila）KMM241中克隆到一個新的木聚糖酶基因xynB，并成功在大腸桿菌（Escherichia coli）中獲得異源表達；GUO Y等[19]將內(nèi)切木聚糖酶基因克隆到枯草芽孢桿菌WB800中進行蛋白表達和鑒定，獲得重組木聚糖酶活性為55 U/mL，比原始菌株酶活性提高了14.5倍；AHMED M A等[25]以Aspergillussp.NRCF5為出發(fā)菌株，利用遺傳變異和原生質(zhì)體融合的方法，通過4輪基因重組獲得了高產(chǎn)木聚糖酶的重組菌；劉卓[35]通過鋅轉(zhuǎn)錄因子與木聚糖酶相關(guān)基因啟動子上游區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)了木聚糖酶的產(chǎn)生，證明了人工鋅指蛋白技術(shù)和核糖體工程技術(shù)在改良放線菌菌種方面是可行的，為探索放線菌木聚糖酶的合成規(guī)律，代謝工程轉(zhuǎn)化海洋酶蛋白奠定了基礎(chǔ)。

4 產(chǎn)木聚糖酶菌株發(fā)酵工藝的研究

發(fā)酵條件也可以影響酶的活力。YU H等[7]從Marinimicrobiumsp.LS-A18中克隆得到木聚糖酶（XylM18）基因，在大腸桿菌BL21（DE3）中異源表達，工程菌發(fā)酵工藝優(yōu)化，重組XylM18對木聚糖的表觀米氏常數(shù)（Km）和Vmax分別為1.60 mg/mL和130.1 U/mg；劉斌等[28]研究結(jié)果顯示，Asteromycessp.TM76發(fā)酵工藝優(yōu)化后，木聚糖酶的最大酶活力為470.5 U/mL；DOS SANTOS J A等[31]通過對493株海洋微生物篩選及相應(yīng)的發(fā)酵工藝優(yōu)化，最終確定Aspergilluscf.tubingensisLAMAI 31可作為木聚糖生產(chǎn)的新菌種；EVELYN N等[34]從鏈霉菌屬中獲得木聚糖酶生產(chǎn)菌株，產(chǎn)木聚糖酶的最優(yōu)工藝為pH8.0、培養(yǎng)溫度35℃、轉(zhuǎn)速150r/min，木聚糖酶的比酶活力為7 417 U/g；林小洪等[40]從福建平潭海域篩選到1株產(chǎn)木聚糖酶活力較高的菌株B659，經(jīng)16S rDNA基因序列分析鑒定為同溫層芽胞桿菌（Stratosphericbacillus），通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，木聚糖酶的活性達到了2 838 U/mL，為優(yōu)化前的3.4倍，發(fā)酵周期也從72 h縮短至30 h。

5 木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用

木聚糖酶被廣泛應(yīng)用于飼料加工、制漿造紙、紡織以及食品等眾多工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在造紙以及紙漿漂白工業(yè)中，木聚糖酶的應(yīng)用更加廣泛[41]。RAGHUKUMAR C等[30]首次報道了一種耐高溫、無纖維素酶的堿性木聚糖酶的粗培濾液在紙漿生物浸出中的潛在應(yīng)用；KHANDEPARKER R等[17]研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶XynBT21具有從麥麩中生產(chǎn)木二糖的潛力；WU J等[27]認(rèn)為木聚糖酶rXynMF13A對饅頭的生產(chǎn)有一定的促進作用，在烘焙、海產(chǎn)品加工中具有應(yīng)用潛力；ROSMINE E等[36]研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶對橙汁、菠蘿汁的澄清率分別為20.87%、27.89%，因此鏈霉菌ER1產(chǎn)生的木聚糖酶可用于果汁澄清；CHENG A C等[42]最近研究證實，在飼料中添加外源木聚糖酶可以改善羅非魚對養(yǎng)分的利用，從而促進魚類的生長；DJOHAN A C等[43]使用本土海洋細菌沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）LBF002的木聚糖酶可將稻草廢料轉(zhuǎn)化為還原糖低聚木糖，如木二糖、木己糖和木糖，將該木聚糖酶與含有25 g/L稻草的反應(yīng)混合物在50 ℃孵育4 h，可獲得1 g/L的還原糖。

6 結(jié)論與展望

海洋木聚糖酶的來源廣泛，在細菌、真菌以及放線菌中都有木聚糖酶被篩選出來。木聚糖酶的應(yīng)用主要體現(xiàn)在：在飼料工業(yè)中，水解飼料里的木聚糖成分，提高飼料的營養(yǎng)價值和利用率；在造紙工業(yè)中，用于紙漿的漂白，減少環(huán)境的污染；在食品行業(yè)上，用來生產(chǎn)功能性木寡糖，改善面包品質(zhì)等。海洋木聚糖酶的產(chǎn)生環(huán)境非常廣泛，包括酸性到堿性環(huán)境以及中度嗜冷到中度嗜熱環(huán)境等[44]。此外，大多數(shù)海洋木聚糖酶都是嗜鹽的，有些可以承受金屬離子的存在，這些金屬離子往往對包括陸源木聚糖酶在內(nèi)的其他酶有抑制作用[45]，這些特征突出了海洋木聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的特殊潛力。對海洋微生物的研究，可能會分離出更多催化潛力更強的海洋木聚糖酶。