不同基源崖桑皮及桑白皮總黃酮含量測定

黃艷萍，周 濃，田 平，谷文超，朱芙蓉，張德全，周 游*

(1. 重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶 404120；2. 大理大學 藥學院，云南 大理 671000；3. 寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市海原縣科學技術(shù)局，寧夏 中衛(wèi) 755200)

桑白皮為?？浦参锷MorusalbaL.]的干燥根皮，入藥可用于肺熱喘咳，水腫脹滿，尿少，面目肌膚浮腫，是2020版《中國藥典》(一部)收載的藥材[1]。崖桑皮為?？浦参镫u桑[MorusaustralisPoir.]或華桑[MoruscathayanaHemsl.]的干燥根皮，入藥與桑白皮具有相似的功效，作為地方習用品主要在重慶、四川、貴州、廣西等地使用，為2010版《四川省中藥材標準》收載的藥材[2]。隨著中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及市場對中藥材原料日益擴大的需求，中藥材原料的多基源現(xiàn)象在一定時期內(nèi)對擴大藥源、滿足成藥需要、保障臨床用藥的需求具有重要的意義。然而不同基源的藥材之間往往成分不同，品質(zhì)參差不齊，難以用統(tǒng)一的標準控制質(zhì)量，同時活性成分含量不同造成了生物活性的差異，難以保證臨床療效，嚴重影響了中藥材的安全性、有效性和可控性。

在2020版《中國藥典》中，桑白皮的鑒定方法僅為簡單的薄層鑒定，即供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的兩個熒光主斑點即可，未對其有效成分含量測定進行規(guī)定。而在2010版《四川省中藥材標準》中，崖桑皮的質(zhì)量鑒定則沿用了《中國藥典》的標準，并且只對水分、灰分的含量進行了規(guī)定，尚無對其活性成分含量的質(zhì)量控制標準。

黃酮類化合物是桑白皮中的藥效物質(zhì)基礎[3]，具有降血壓、降血脂、鎮(zhèn)咳祛痰、抗病毒、抗癌、治療骨質(zhì)疏松[4-9]的作用。由于崖桑皮作為原料藥入藥時的安全與功效方面的技術(shù)標準與基礎研究不足，迄今未形成完整的相關(guān)使用規(guī)范和技術(shù)標準。同時，有關(guān)雞桑和華桑在化學成分方面是否存在明顯差異，是否能等同入藥尚缺少有力研究支撐?；诖耍狙芯恳浴吨袊幍洹?2020年版)收載的桑白皮進行對照，首次對不同基源的崖桑皮進行了有效化學成分比較，采用紫外-可見光分光光度法對不同基源的崖桑皮和桑白皮中總黃酮的含量進行了測定，以期進一步規(guī)范和完善崖桑皮藥材的質(zhì)量評價方法，為藥材標準的修訂提供科學依據(jù)，也為其它多基源中藥的品質(zhì)評價提供示范。

1 材料與儀器

1.1 儀器

UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津集團)；SB-5200DTN型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)；ML204型分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；CP225D型分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥

對照品桑辛素(批號：DST180729-069，純度：98%)購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，甲醇(批號：MFCD00004595)、冰乙酸(批號：MFCD00036152)、乙酸鈉(批號：MFCD00012459)、氯化鋁(批號：MFCD00149134)購自南京試劑有限公司，均為分析純。

1.3 材料

桑、雞桑、華桑于2018年10月采集于重慶市相關(guān)區(qū)縣，共53批(表1)，對照藥材購自相關(guān)中藥材市場及公司，經(jīng)重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為?？浦参镫u桑(M.australis)、華桑(M.cathayana)、桑(M.alba)。根皮洗凈后置于45℃烘干至恒重，粉碎，密封儲存于4℃，用于品質(zhì)分析，待用。

表1 不同產(chǎn)地的樣品信息Table 1 The information of samples from different origins

2 方法與結(jié)果

參照楊晶[10]等條件并加以改進，具體操作如下。

2.1 對照品溶液制備

取適量的桑辛素對照品，精密稱量至0.000 1 g，用80%甲醇將其稀釋為80 μg·mL-1即得。

2.2 顯色方法

取1.0 mL對照品溶液于10 mL比色管中，分別加入0.1 mol·L-1氯化鋁溶液2.0 mL和0.1 mol·L-1乙酸鈉-乙酸溶液3 mL，用甲醇定容至刻度，搖勻，室溫下放置10 min進行顯色反應。利用紫外-可見分光光度計測定其吸光度，在350～500 nm波長范圍內(nèi)進行波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在400 nm波長處有強吸收(圖1)。因此，選擇總黃酮的檢測波長為400 nm。

圖1 桑辛素的光譜掃描圖Fig.1 UV wavelength selection of morusin

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取桑辛素對照品溶液0.025、0.125、0.375、0.75、1.0 mL，按照2.2項下的方法進行顯色反應，于400 nm波長處測定吸光度。以桑辛素對照品的濃度(0.2、1.0、3.0、6.0、8.0 μg·mL-1)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，回歸方程為y=0.013x+0.009 1，R2=0.999 9。由結(jié)果可知，桑辛素的在2～80 μg·mL-1的線性關(guān)系良好。

2.4 提取溶劑考察

分別考察不同體積濃度(30%、50%、70%、80%、100%)甲醇、乙醇溶液的提取效果。精密稱取桑白皮粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加上述溶劑50 mL，超聲提取30 min后取出，以4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，取1.0 mL按照2.2項下的方法進行顯色反應并測量。結(jié)果顯示，提取溶劑為80%甲醇的提取效果最佳(表2)。

表2 不同提取溶劑比較Table 2 Comparison of different extraction solvents

2.5 提取時間考察

精密稱取藥材粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加80%甲醇50 mL，分別超聲15、30、45、60 min后取出，以4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液1.0 mL按照2.2項下的方法進行顯色反應、測量。結(jié)果如表3所示，超聲提取45 min的提取效果最佳(表3)。

表3 不同提取時間比較Table 3 Comparison of different extraction times

2.6 提取次數(shù)考察

取藥材粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加80%甲醇50 mL，分別超聲45 min 1次、2次、3次后取出，以4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液1.0 mL按照2.2項下的方法進行顯色反應并測量。結(jié)果如表4所示，提取1次即可達到最佳效果(表4)。

表4 不同提取次數(shù)比較Table 4 Comparison of different extraction frequencies

2.7 供試品溶液的制備

綜合前述單因素試驗結(jié)果，精密稱取藥材粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加80%甲醇50 mL，超聲提取45 min，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量后取出，以4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液1.0 mL待顯色。

2.8 精密度考察

精密吸取同一供試品溶液1.0 mL，平行6份，按2.2項下的方法顯色后，測定吸光度并計算總黃酮含量，結(jié)果顯示各樣品吸光度的RSD為0.095 %(表5)，表明儀器精密度良好。

表5 精密度考察Table 5 Precision study

2.9 穩(wěn)定性考察

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各1.0 mL，按2.2項下的方法顯色后，分別在0、20、40、60、80、100、120 min時測定吸光度并計算總黃酮含量。結(jié)果顯示各時間段吸光度的RSD為0.363%(表6)。表明在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性考察Table 6 Stability study

2.10 加樣回收試驗

取已知含量的崖桑皮藥材粉末0.25 g，精密稱定，加入30 μg·mL-1的桑辛素對照品溶液1.0 mL，平行6份，按2.7項下制備供試品溶液，2.2項下的方法顯色后測定吸光度。結(jié)果顯示，平均回收率為101.641%，RSD為2.670%，符合分析要求(表7)。

表7 加樣回收試驗Table 7 Sample recovery test

2.11 樣品測定

取58批藥材按照2.7項下制備供試品溶液，2.2項下的方法顯色后測定吸光度，計算總黃酮含量，詳見表8。結(jié)果可知，崖桑皮中總黃酮的含量為9.731～54.706 mg·g-1，平均含量為33.329 mg·g-1，其中華桑根皮中總黃酮的含量為16.479～54.706 mg·g-1，平均含量為32.669 mg·g-1；雞桑根皮中總黃酮的含量為9.731～50.464 mg·g-1，平均含量為34.651 mg·g-1。桑白皮中總黃酮的含量為20.149～75.090 mg·g-1，平均含量為40.521 mg·g-1。

表8 總黃酮的含量比較Table 8 Comparison of total flavonoids ± s, n =3)

2.12 獨立樣品t檢驗

采用軟件SPSS 22.0對全部樣品進行獨立樣本t檢驗分析，觀察崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量之間的差異、來源于雞桑的崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量的差異、來源于華桑的崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量的差異以及來源于雞桑和華桑的崖桑皮之間總黃酮含量的差異。結(jié)果表明，崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量不存在顯著差異，分別來源于華桑和雞桑的崖桑皮之間總黃酮含量不存在顯著差異，來源于雞桑的崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量不存在顯著差異，而來源于華桑的崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量存在顯著差異(表9)。

表9 獨立樣品t檢驗Table 9 Independent t-test

3 討 論

紫外分光光度法測定藥材有效成分的方法具有簡便、快捷、準確、可靠的特點。參考楊晶[10]等的方法，以桑辛素為對照品測定了野生雞桑、華桑、桑的根皮，對照藥材崖桑皮、桑白皮等共計58批藥材中總黃酮的含量，并對前人的方法做了調(diào)整改進。本研究首次對崖桑皮藥材有效成分的含量進行了測定，填補了以往關(guān)于崖桑皮質(zhì)量檢測的空白。結(jié)果顯示，雞桑、華桑、桑的根皮中總黃酮含量多數(shù)在20～40 mg·g-1之間，野生桑根皮中的總黃酮含量均高于對照藥材桑白皮中總黃酮的含量；除Y28外，野生雞桑、華桑根皮中的總黃酮含量基本高于對照藥材崖桑皮中總黃酮的含量；t檢驗的結(jié)果則表明崖桑皮與桑白皮之間總黃酮含量不存在顯著性差異，在一定程度上具有質(zhì)量等同性，分別來源于雞桑和華桑的崖桑皮之間總黃酮含量顯著性差異，可以作為多基源藥材的保證。