基于納米材料的信號(hào)放大策略作用于電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究

熊成義， 梁文斌， 劉 雄， 鄭瑩寧， 柴雅琴*,袁若*

（1. 西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 重慶400715）

（2. 湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 湖北武漢430062）

（3. 湖北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站， 湖北武漢430072）

0 引言

電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)是集合電化學(xué)的電位可控性和化學(xué)發(fā)光的高靈敏性優(yōu)點(diǎn)的新型分析技術(shù)，通過(guò)施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)， 在電極表面產(chǎn)生電生物質(zhì)，然后這些物質(zhì)與自身或者體系中的其他組分因電子傳遞作用而轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，隨后從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的過(guò)程，并在此過(guò)程中伴隨著發(fā)光現(xiàn)象[1-2]。自Kuwana 等成功發(fā)掘出魯米諾的電致化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)原理及其發(fā)光機(jī)理以來(lái)，電致化學(xué)發(fā)光體系受到了更多的關(guān)注[3]。

隨著ECL 的蓬勃發(fā)展，它在生命分析領(lǐng)域也逐漸有了一席之地。 生命分析對(duì)于發(fā)光體的生物相容性要求很高，而傳統(tǒng)的ECL 體系無(wú)法滿足這一條件，因此納米材料直接作為ECL 發(fā)光體逐漸占據(jù)了研究的核心位置，以金屬量子點(diǎn)、碳點(diǎn)和金屬納米簇為其代表。這些ECL 發(fā)光體具有較高的生物相容性、合成成本低及穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。

1 新型電致化學(xué)發(fā)光納米材料

雖然研究者們發(fā)現(xiàn)了許多物質(zhì)的電致化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，但是能夠應(yīng)用于實(shí)際的類型并不多。其中以酰肼類化合物的代表——魯米諾（luminol），吖啶類化合物的代表光澤精(lucigenin)及金屬配合物——釕（Ru）配合物的應(yīng)用較為廣泛。

量子點(diǎn)（quantum dots）是指三個(gè)維度的尺寸都小于材料內(nèi)部電子的費(fèi)米波長(zhǎng)的納米晶粒，屬于三維尺度限域的零維納米材料。 由于在量子點(diǎn)內(nèi)部電子在各個(gè)維度上的運(yùn)動(dòng)都受到限制，使得量子點(diǎn)內(nèi)部的電子和空穴被強(qiáng)烈限域，準(zhǔn)連續(xù)能帶結(jié)構(gòu)變?yōu)榉至⒛芗?jí)結(jié)構(gòu)， 因此可以產(chǎn)生熒光。相比傳統(tǒng)的有機(jī)熒光分子，量子點(diǎn)具備一些獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，如發(fā)射光譜可調(diào)諧、抗光漂白、寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜、 較大的斯托克斯位移、良好的生物相容性以及熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)成像、光學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域。量子點(diǎn)的ECL 現(xiàn)象于2002 年首次被報(bào)道，隨后， 包括CdSe 量子點(diǎn)[4]、 ZnS 量子點(diǎn)[5]、碳量子點(diǎn)[6]等多種類型量子點(diǎn)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)具有ECL 現(xiàn)象。 由于量子點(diǎn)具有優(yōu)異的發(fā)光性能，良好的生物相容性，以及可重復(fù)激發(fā)的特點(diǎn)被認(rèn)為是理想的替代聯(lián)吡啶釕的ECL 發(fā)光物質(zhì)。 近年來(lái)，量子點(diǎn)ECL 體系成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，被廣泛應(yīng)用于各類ECL 生物傳感器。自2009 年Bard 課題組發(fā)現(xiàn)硅量子點(diǎn)之后，各種金屬量子點(diǎn)逐漸走進(jìn)研究者們的視野[7]。 Ju 等首次報(bào)道了CdTe QDs 的陽(yáng)極ECL 現(xiàn)象[8]。 當(dāng)他們把CdTe QDs 固載在氧化銦錫電極上，置于pH 值為9．3 的介質(zhì)溶液中時(shí)，可以獲得強(qiáng)的陽(yáng)極ECL 信號(hào)，并且在+1．17 V(vs．Ag/AgCl) 電位下ECL 強(qiáng)度值達(dá)到最大。 除此之外，Ju 等還研究了多巴胺 （DA） 在該條件下對(duì)CdTe QDs 的猝滅機(jī)制，如圖1 所示。

圖1 量子點(diǎn)的陽(yáng)極ECL 機(jī)理（A）和多巴胺的氧化產(chǎn)物對(duì)它的猝滅過(guò)程（B）Fig．1 Anodic ECL Mechanism of QDs(A)and Its Quenching Procedure by Oxidation Product of DA(B)

鎘基量子點(diǎn)合成工藝成熟，成本低廉，是構(gòu)建ECL 生物傳感器中最常用的量子點(diǎn)之一，鞠熀先教授研究小組將CdSe QDs 修飾到電極表面，再修飾凝集素作為糖基的識(shí)別元件， 以S2O82-為共反應(yīng)試劑增強(qiáng)CdSe QDs ECL 信號(hào)， 構(gòu)建高靈敏生物傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面糖基化表達(dá)水平定量分析[9]。 糖基化的細(xì)胞能夠被凝集素識(shí)別而附加到電極界面，阻礙電子傳遞，引起ECL 信號(hào)降低。 具體檢測(cè)原理如圖2 所示。 鎘基量子具有較好的ECL 性能，然而，關(guān)于其生物毒性的研究表明， 鎘基量子點(diǎn)存在一定程度的鎘離子泄漏，造成一定的生物毒性，同時(shí)也對(duì)分析人員健康造成潛在的威脅，因此，人們開(kāi)始把目光轉(zhuǎn)向無(wú)毒性重金屬的新型量子點(diǎn)。

圖2 ECL 細(xì)胞傳感器的構(gòu)建原理圖Fig．2 Schematic representation of ECL cytosensor for monitoring cell surface carbohydrate expression

為進(jìn)一步提高金屬量子點(diǎn)的ECL 性能，復(fù)合型的金屬量子點(diǎn)也相繼問(wèn)世， 如CdS:Mn QDs、CdSe＠ZnS QDs[10-11]。 Zhu 課題組提出，利用刮削涂覆在電極上制備高效的鈣鈦礦型QDs 薄膜的方法， 并借此合成了具有強(qiáng)ECL 性能的CsPbBr3QDs[12](圖3)。

圖3 (a)CsPbBr3 QDs 的立方晶體結(jié)構(gòu)示意圖；(b)CsPbBr3 QDs 的熒光和紫外吸收光譜；（c）CsPbBr3 QDs 的高清TEMFig．3 (a)The schematic cubic crystal structure of CsPbBr3 QDs．(b)Fluorescence and UV-vis absorbance spectra of CsPbBr3 QDs dispersed in hexane．The inset shows photographs of CsPbBr3 QDs under visible and UV light．(c)HRTEM image of CsPbBr3 QDs

這些半導(dǎo)體金屬量子點(diǎn)雖然在一定程度上提高了ECL 發(fā)光體的生物相容性，但是重金屬離子的生物毒性限制了它們?cè)谏治鲱I(lǐng)域的深入應(yīng)用。

二硫化鉬（MoS2）是一類具有類似石墨烯獨(dú)特二維結(jié)構(gòu)的過(guò)渡金屬二硫化物半導(dǎo)體納米材料，具有良好的生物相容性。 采用top-down 的制備工藝，在有機(jī)溶劑中回流，可以獲得生物相容性好的，無(wú)有機(jī)配體的MoS2量子點(diǎn)。Zhao 等將這種MoS2量子點(diǎn)用作ECL 發(fā)光物質(zhì)， 表現(xiàn)出較強(qiáng)的ECL 信號(hào)，并且能夠被經(jīng)典的胺類共反應(yīng)試劑三乙胺顯著增強(qiáng)，基于此MoS2量子點(diǎn)ECL 體系，結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增信號(hào)放大策略構(gòu)建的ECL 適體傳感器，實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素（LPS）的靈敏檢測(cè)[13]。 首先，將合成的MoS2量子點(diǎn)富集到Pd-Au 多面體復(fù)合物表面并在電極上成膜，為傳感器提供初始ECL 信號(hào)，進(jìn)一步組裝引物構(gòu)建生物傳感平臺(tái)，LPS 能夠引發(fā)從引物開(kāi)始的滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生有大量串聯(lián)的富G 堿基片段的產(chǎn)物嵌入hemin 形成hemin/G-四分體， 能有效地淬滅MoS2QDs/TEA 體系的ECL 信號(hào)，ECL 信號(hào)的減小值隨LPS 濃度的增加而增加。 具體過(guò)程如圖4 所示。

圖4 基于二硫化鉬量子點(diǎn)的生物傳感器構(gòu)建原理圖(A)MoS2＠Pd-Au 的制備過(guò)程Fig．4 Schematic Illustration of the Ultrasensitive “on-off”ECL Aptasensor for LPS Detection Based on Aptamer Recognition-Driven Target-Cycling Synchronized RCA:(A)Preparation Process of MoS2＠Pd-Au

除了過(guò)渡金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)，常用于ECL 生物傳感器的有碳量子點(diǎn)(碳點(diǎn)，CDs)。 碳量子點(diǎn)是一系列直徑小于10 納米， 具有特定的發(fā)光特性的碳納米材料，其中一些具有類似石墨烯的二維平面結(jié)構(gòu)的碳量子點(diǎn)也被稱為石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）。 碳量子點(diǎn)繼承了碳納米材料所具備的優(yōu)異的導(dǎo)電性、良好的生物相容性和穩(wěn)定的化學(xué)性能，同時(shí)其發(fā)光強(qiáng)度大，獲取成本低廉，相比金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有突出的優(yōu)勢(shì)[14]。 因此，碳量子點(diǎn)在生物成像、生物傳感器和發(fā)光器件等應(yīng)用領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注[15-16]。 2008 年，Chi 小組首次報(bào)道了電解石墨產(chǎn)生的碳量子點(diǎn)的ECL 現(xiàn)象，促使碳量子點(diǎn)成為ECL 領(lǐng)域的一顆新星，在ECL生物傳感器的構(gòu)建上受到研究者們的青睞。

Liu 等將碳量子點(diǎn)直接修飾到電極表面成膜，作為ECL 信號(hào)源，以修飾了hemin/G-四分體的納米金作為ECL 猝滅探針， 構(gòu)建了ECL 生物傳感器檢測(cè)蛋白激酶A（PKA）[17]。 目標(biāo)物蛋白激酶A 在ATP 的輔助下， 能夠?qū)⑿揎椩陔姌O上的多肽底物磷酸化，在Zr4+離子存在的條件下，猝滅探針依靠磷酸與Zr4+離子的配位鍵結(jié)合到電極表面，實(shí)現(xiàn)ECL 信號(hào)響應(yīng)。 具體過(guò)程如圖5 所示。

圖5 以GQDs 為基底構(gòu)建的PKA 生物傳感器構(gòu)建示意圖Fig．5 Schematic illustration of ECL assay for PKA based on double-quenching of GQDs by pDNA＠DNAzyme-AuNPs

碳量子點(diǎn)化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，屬于較難通過(guò)電化學(xué)反應(yīng)獲得激發(fā)態(tài)的一類發(fā)光物質(zhì)， 因此，大多數(shù)情況下需要使用強(qiáng)氧化性的過(guò)硫酸鹽作為共反應(yīng)試劑并施加一定的負(fù)電壓， 這對(duì)碳量子點(diǎn)在ECL 生物傳感器中的應(yīng)用存在一定的限制作用。 Dong 等發(fā)現(xiàn)將電化學(xué)掃描拓展到-1．3 ～+1．4 V 的電壓范圍內(nèi)， 亞硫酸鹽也能有效地增強(qiáng)碳量子點(diǎn)的ECL 信號(hào)，為碳量子點(diǎn)在ECL 生物傳感器中的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新的途徑。 研究表明，寬的電化學(xué)掃描范圍是亞硫酸根離子 （SO32-）能夠轉(zhuǎn)化為活性中間體硫酸根自由基（SO4·-），從而使碳量子點(diǎn)得以產(chǎn)生激發(fā)態(tài)[18]。 具體機(jī)理如圖6所示。

圖6 CQD-SO32-系統(tǒng)的ECL 反應(yīng)原理圖Fig．6 Schematic diagram for the ECL reaction mechanism of CQD-SO32-system

碳量子點(diǎn)是一種納米晶體，盡管具有一定有機(jī)物的特征，其碳核具有較高的結(jié)晶度，這是鑒別碳量子點(diǎn)的重要特征之一，也是碳量子點(diǎn)發(fā)光特性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 但是近期的研究發(fā)現(xiàn)，有一些有機(jī)聚合物，盡管沒(méi)有晶體特征而不能歸入碳量子點(diǎn)， 也具有包括ECL 在內(nèi)的獨(dú)特的發(fā)光現(xiàn)象，被稱為聚合物點(diǎn) （PFO）。 Chen 等利用H2O2對(duì)CdTe 量子點(diǎn)ECL 增強(qiáng)而對(duì)PFO 的ECL 猝滅的特點(diǎn)構(gòu)建了比率型ECL 酶?jìng)鞲衅鳎瑢?shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留（OPs）的靈敏檢測(cè)。如圖7 所示，以石墨烯作為載體，修飾CdTe 量子點(diǎn)和PFO 構(gòu)成納米復(fù)合物， 在電極上成膜提供雙電位的ECL 信號(hào)，然后，繼續(xù)修飾乙酰膽堿酯酶（AChE）和膽堿氧化酶（ChOx），檢測(cè)底液中加入乙酰膽堿；當(dāng)?shù)滓褐袥](méi)有OPs 時(shí)，乙酰膽堿通過(guò)AChE 的作用轉(zhuǎn)化為硫代膽堿（R-SH）， 然后進(jìn)一步通過(guò)ChOx 被氧化，其巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵并伴隨著過(guò)氧化氫的生成，此時(shí)CdTe 量子點(diǎn)的ECL 信號(hào)增強(qiáng)而PFO 的信號(hào)受H2O2猝滅； 當(dāng)?shù)滓褐写嬖贠Ps 時(shí)，OPs 能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性， 從而抑制H2O2的生成，CdTe 量子點(diǎn)的ECL 信號(hào)降低而PFO 的信號(hào)增強(qiáng)，通過(guò)兩種ECL 信號(hào)的比率變化，從而實(shí)現(xiàn)OPs 的檢測(cè)[19]。 具體過(guò)程如圖7 所示。

圖7 基于PFO 聚合物點(diǎn)與CdTe 量子點(diǎn)構(gòu)建的雙響應(yīng)ECL 生物酶?jìng)鞲衅髟韴DFig．7 Schematic Description of the Biosensor Fabrication and Response Mechanism

金屬納米簇是一類由幾個(gè)到大約一百個(gè)原子組成的一種金屬納米顆粒， 其直徑通常小于2 nm，它們的性質(zhì)介于單核金屬配合物和大的金屬納米粒子之間。 對(duì)于單核配合物，它具有量子化的電子能級(jí)；大的金屬納米顆粒仍然是一個(gè)等離子體，具有連續(xù)能帶的離域電子能級(jí)；而納米簇則介于兩者之間。 由于納米簇的尺寸接近于電子的費(fèi)米波長(zhǎng)， 連續(xù)態(tài)能帶分裂成分立的能級(jí)，隨著尺寸的減小， 納米簇的成鍵能級(jí)與反鍵能級(jí)都將減小，禁帶寬度則增大。當(dāng)原子數(shù)小到一定的范圍時(shí)，納米簇就能夠具備在可見(jiàn)光區(qū)的熒光發(fā)射。

與量子點(diǎn)類似，金屬納米簇同樣具有ECL 行為。 2009 年，Diez 教授首次報(bào)道了聚合物穩(wěn)定的銀納米簇的ECL 現(xiàn)象[20]。 更加可貴的是，最常見(jiàn)的由金、銀、鉑、鈀等生物毒性低的元素組成的納米簇具有比一般半導(dǎo)體量子點(diǎn)更加優(yōu)越的生物相容性，因此，金屬納米簇已經(jīng)成為一類非常重要的ECL 探針成為研究的熱點(diǎn)。金納米簇是目前為止在ECL 領(lǐng)域研究得最多，應(yīng)用最廣泛的一種貴金屬納米簇。金納米簇ECL 體系既可以是以過(guò)硫酸鹽共反應(yīng)試劑的陰極發(fā)光，也可以是以叔胺（三丙胺、三乙胺等）為共反應(yīng)試劑的陽(yáng)極發(fā)光。其中，陽(yáng)極發(fā)光由于條件相對(duì)溫和更受研究者們的關(guān)注。 Chen 等以三乙胺作為共反應(yīng)試劑，將金納米簇底涂到電極表面成膜提供ECL 信號(hào)，以二茂鐵功能化的PdPt 納米立方標(biāo)記二抗， 構(gòu)建了夾心型ECL 生物傳感器監(jiān)測(cè)ConA[21]。 二茂鐵能夠有效猝滅金納米簇的ECL 信號(hào)， 當(dāng)檢測(cè)到ConA 時(shí)，猝滅探針組裝到電極表面，ECL 信號(hào)降低。 具體如圖8 所示。

圖8 PtPd NCs 和GOD＠Fc-COOH-PtPd NCs 的合成示意圖以及ECL 生物傳感器的制備原理圖Fig．8 The illustration of the synthetic process of PtPd NCs and GOD＠Fc-COOH-PtPd NCs,and the preparation of the ECL biosensor

相比金納米簇， 銀納米簇在化學(xué)穩(wěn)定性，生物相容性上有所不如，但是在發(fā)光性能有一定的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，由于銀納米簇可以在特定的DNA 模板上原位合成，因此，在ECL 生物傳感器中同樣受到青睞。Chen 等以滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生的由大量富胞嘧啶片段串聯(lián)而成的長(zhǎng)鏈DNA 為模板， 原位生成銀納米簇作為ECL 信號(hào)探針， 構(gòu)建了超靈敏ECL 生物傳感器檢測(cè)miRNA[22]。 首先，構(gòu)建了一個(gè)多功能的DNA 環(huán)形模板， 不僅作為滾環(huán)擴(kuò)增的模板，是擴(kuò)增產(chǎn)物中包含大量串聯(lián)的富胞嘧啶片段，同時(shí)控制目標(biāo)物miRNA 識(shí)別，僅在目標(biāo)物miRNA 存在時(shí)，滾環(huán)擴(kuò)增才能啟動(dòng)，在滾環(huán)擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)，目標(biāo)物被置換進(jìn)入下一循環(huán)。 滾環(huán)擴(kuò)增完成后，只需孵育AgNO3后漂洗電極，然后通過(guò)電化學(xué)還原的方式， 在DNA 上原位生成銀納米簇，產(chǎn)生ECL 信號(hào)。 具體過(guò)程如圖9。

圖9 目標(biāo)物循環(huán)同步滾環(huán)放大結(jié)合原位電化學(xué)生成電致化學(xué)發(fā)光銀納米簇檢測(cè)MicroRNAFig．9 Schematic Illustration of(A)the Principle of Target-Cycling Synchronized RCA and in Situ Electrochemical Generation of Ag NCs,(B)Preparation of the Circular Template,and(C)ECL Mechanism of Ag NCs/S2O82--Based ECL System Copyright 2017 ACS

除了單一金屬構(gòu)成的納米簇，合金納米簇由于其更好的電化學(xué)活性， 也開(kāi)始進(jìn)入人們的視野。 汪爾康教授課題組以牛血清白蛋白（BSA）為配體合成了金銀合金納米簇，并以其作為信號(hào)探針構(gòu)建了ECL 傳感器檢測(cè)汞離子。該合金納米簇相比單獨(dú)的金納米簇和銀納米簇具有更好的ECL 性能， 但是汞離子可以通過(guò)與納米簇結(jié)合高效猝滅ECL 信號(hào)， 由此實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的信號(hào)響應(yīng)[23]。 具體如圖10 所示。

圖10 (A)Au-Ag 合金納米簇的制備；(B)Au-Ag 合金納米簇的ECL 反應(yīng)機(jī)理以及ECL 傳感器對(duì)Hg2+的檢測(cè)Fig．10 (A)Preparation Process of Au-Ag Bimetallic NCs;(B)ECL Mechanisms of Au-Ag Bimetallic NCs and the Proposed ECL Sensor for Hg2+Detection

與貴金屬納米簇相比，銅納米簇則在成本方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。 Zhao 等報(bào)道了銅納米簇的ECL 現(xiàn)象并研究了聯(lián)氨作為共反應(yīng)試劑的ECL機(jī)理，基于該ECL 體系構(gòu)建了檢測(cè)多巴胺的ECL傳感器[24]。如圖11 所示，聯(lián)氨被電化學(xué)沉積到玻碳電極表面，能夠高效地增強(qiáng)了銅納米簇的ECL信號(hào)，多巴胺則是該體系的猝滅劑。

圖11 基于銅簇的ECL 傳感器構(gòu)建示意圖Fig．11 Schematic Showing the Preparation Process of Cu NCs and the Photo and Typical HRTEM Image of the As Prepared Cu NCs(A),Sketch Diagram of the Sensing Platform for DA Detection Based on the Cu NCs/HZ ECL System(B),and Proposed ECL Enhancing Mechanism of the Cu NCs/HZ System and ECL Quenching Mechanism by DA toward the Cu NCs/HZ System(C)Copyright 2017 ACS

2 納米材料信號(hào)放大平臺(tái)

隨著粒徑的變小，納米材料表面原子與總原子數(shù)之比急劇增大，比表面積、表面原子數(shù)迅速增加，會(huì)引起性質(zhì)上旳巨大變化。 表面原子的晶體場(chǎng)環(huán)境和結(jié)合能與內(nèi)部原子不同，表面原子周圍缺少相鄰的原子，有許多懸空鍵，具有不飽和性質(zhì)，易于其他原子相結(jié)合而穩(wěn)定下來(lái)，因而表現(xiàn)出很高的化學(xué)和催化活性。 由于具有很高的比表面積和化學(xué)活性，納米材料在ECL 分析領(lǐng)域常被用為納米載體，富集ECL 活性物質(zhì)（發(fā)光物質(zhì)或其他活性分子），以提高分析方法的靈敏度。

王柯敏教授課題組利用介孔硅高比表面積及多孔特性，將ECL 發(fā)光物質(zhì)聯(lián)吡啶釕吸附到生長(zhǎng)在電極表面的介孔硅膜的孔洞中，并使用各種靶標(biāo)的核酸適配體分子封閉介孔硅的孔洞，從而構(gòu)建了免標(biāo)記的通用ECL 適體傳感平臺(tái)[25]。 其中，介孔材料是指孔徑介于2～50 nm 的一類多孔材料，具有極高的比表面積。 介孔硅對(duì)聯(lián)吡啶釕的高效吸附，是決定ECL 傳感器高靈敏度的關(guān)鍵因素。 具體過(guò)程如圖12。

圖12 (A)Apt-Ru＠MSFs/ITO 的制備(B)傳感器的構(gòu)建示意圖Fig．12 Schematic Illustration of(A)the Preparation of Apt-Ru＠MSFs/ITO and(B)Apt-Ru＠MSFs/ITO-Assisted ECL Aptasensor Platform for Target Detection．Copyright 2017 ACS

有些ECL 體系中，其發(fā)光物質(zhì)不如其共反應(yīng)試劑/猝滅劑容易標(biāo)記或固載， 如過(guò)硫酸鹽ECL體系，可通過(guò)納米材料富集相關(guān)體系的共反應(yīng)試劑/猝滅劑，提高反應(yīng)試劑/猝滅劑增強(qiáng)/降低ECL信號(hào)的能力。 基于這樣納米復(fù)合物，可以構(gòu)建信號(hào)增強(qiáng)（或減?。┑姆治龇椒?，同樣能夠取得較高的靈敏度。 Zhao 等將聚組氨酸（過(guò)硫酸鹽ECL 體系的共反應(yīng)試劑） 修飾到納米金功能化的C60復(fù)合納米材料表面獲得的復(fù)合納米材料，表現(xiàn)出對(duì)過(guò)硫酸鹽ECL 體系的高效增強(qiáng)[26]。 利用該復(fù)合納米材料修飾電極，為信號(hào)減小型ECL 生物傳感器提供更強(qiáng)的ECL 初始信號(hào)，從而提高傳感器的靈敏度。 具體過(guò)程如圖13。

圖13 ECL 適體傳感器的原理圖Fig．13 The schematic diagram of the preparation of the ECL aptasensor．Copyright 2015 Elsvier

納米材料所具備的高比表面積的特性賦予其良好的吸附能力，實(shí)現(xiàn)ECL 發(fā)光物質(zhì)或共反應(yīng)試劑的大量固載， 獲得ECL 性能好的納米復(fù)合物。 另有一類納米材料則是由發(fā)光物質(zhì)或共反應(yīng)試劑直接構(gòu)成，相比表面吸附，其固載效率更高。Wang 等將自增強(qiáng)聯(lián)吡啶釕衍生物制備成納米棒，并將其作為信號(hào)標(biāo)簽，構(gòu)建超靈敏ECL 免疫傳感器。 這類納米材料將固載活性物質(zhì)的能力推向最大化，從而能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的ECL 信號(hào)，有效地提高傳感器的靈敏度[27]。 具體過(guò)程如圖14。

圖14 (A)釕納米棒的制備；(B)ECL 免疫傳感器的制備及反應(yīng)機(jī)理Fig．14 (A)Preparation of[(Ru(bpy)2(mcbpy)2+)-TAPA]NRs;(B)Fabrication of the Immunosensor and the Reacted Mechanism．Copyright 2016 ACS

以上工作表明，納米材料通過(guò)其強(qiáng)大的固載能力， 使大量的ECL 活性物質(zhì)能夠進(jìn)入傳感界面， 從而產(chǎn)生更靈敏的ECL 信號(hào)相應(yīng)， 實(shí)現(xiàn)對(duì)ECL 生物傳感器的信號(hào)放大。

除了作為納米載體富集ECL 活性物質(zhì)之外，有些納米材料由于其本身的光電性質(zhì)， 能夠?qū)CL 過(guò)程產(chǎn)生增強(qiáng)或者猝滅效果。 例如，納米金（Au NPs）在紫外-可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)具有較大的吸收系數(shù)和較寬的吸收范圍等優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，可作為很多發(fā)光體的能量受體（猝滅劑）。 當(dāng)Au NPs與發(fā)光體距離較近時(shí)，能夠發(fā)生ECL 共振能量轉(zhuǎn)移（E-RET）高效猝滅ECL 發(fā)光。 陳洪淵課題組將Au NPs 與ECL 發(fā)光體分別標(biāo)記到富G 堿基DNA的兩端， 利用K+誘導(dǎo)富G 堿基DNA 序列折疊成G-四分體結(jié)構(gòu)的特性， 當(dāng)K+存在時(shí)，DNA 折疊成G 四分體結(jié)構(gòu)，引起Au NPs 靠近被固定在電極表面的ECL 發(fā)光體，引起ECL 猝滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)K+的響應(yīng)[28]。 當(dāng)Au NPs 與發(fā)光體的距離在適當(dāng)?shù)姆秶鷷r(shí)， 由于局部表面等離子共振效應(yīng)（LSPR），又能夠增強(qiáng)某些ECL 體系的發(fā)光（圖15）。

圖15 基于CdS NCs 與AuNPs 間能量轉(zhuǎn)移的ECL 傳感器構(gòu)建原理圖Fig．15 Preparation of the ECL biosensor for K+assay based on energy transfer between CdS NCs and AuNPs Copyright 2013 RSC

最近，袁若教授課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，有一些特定的物質(zhì)，其本身不能產(chǎn)生ECL 信號(hào)，也不能作為共反應(yīng)試劑單獨(dú)用于增強(qiáng)發(fā)光試劑的ECL 信號(hào)強(qiáng)度，但是卻可以加速共反應(yīng)試劑與發(fā)光試劑間的相互作用，幫助共反應(yīng)試劑進(jìn)一步增強(qiáng)ECL 信號(hào)，這類物質(zhì)統(tǒng)稱為共反應(yīng)促進(jìn)劑。 其中，納米材料作為共反應(yīng)促進(jìn)劑由于可以同時(shí)兼具納米載體的功能而成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Zhou 等發(fā)現(xiàn)TiO2納米材料可以作為共反應(yīng)促進(jìn)劑， 有效提高銀納米簇-溶解氧ECL 體系的發(fā)光性能，通過(guò)在TiO2納米花表面原位合成銀納米簇制備復(fù)合納米材料作為信號(hào)標(biāo)簽， 構(gòu)建了ECL 免疫傳感器[29]，實(shí)現(xiàn)β-淀粉樣蛋白（Aβ）的靈敏檢測(cè)，具體過(guò)程如圖16。該工作中，TiO2納米花不僅扮演了納米載體的角色，富集了大量的發(fā)光物質(zhì)，同時(shí)，還能夠促進(jìn)銀納米簇-溶解氧ECL體系的共反應(yīng)作用，增強(qiáng)ECL 信號(hào)強(qiáng)度。 機(jī)理研究表明，TiO2納米材料由于表面缺陷具有出色的催化性能，通過(guò)催化溶解氧的轉(zhuǎn)化，可以生成具有強(qiáng)反應(yīng)活性的羥基自由基（OH·），從而提高銀納米簇的激發(fā)效率，實(shí)現(xiàn)ECL 信號(hào)增強(qiáng)。

圖16 以Ag NCs-TiO2 NFs 為基礎(chǔ)構(gòu)建的ECL 生物傳感器原理圖Fig．16 Schematic Diagrams Showing the Preparation of Ag NCs-TiO2 NFs(A),Ultrasensitive Detection of Aβ by Combining Immunoreaction-Induced DNA Nanostructure with Fc-Driven Light Switch Biodetection(B),and Possible ECL Emitting Mechanism of Ag NCs-TiO2 NFs(C)．Copyright 2017 ACS

無(wú)論是通過(guò)納米材料富集ECL 活性物質(zhì)，或者參與ECL 反應(yīng)過(guò)程， 都是以直接增強(qiáng)/猝滅ECL 體系信號(hào)強(qiáng)度的方式，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高ECL 生物傳感器的靈敏度。 為適應(yīng)傳感器小型化的發(fā)展潮流，隨著精準(zhǔn)化學(xué)的發(fā)展，誕生了一類將生物放大策略集成到納米材料界面的新型信號(hào)放大技術(shù)。 由于有意識(shí)的控制和優(yōu)化了生物分子的動(dòng)力學(xué)行為，這種集成在納米材料界面的生物放大策略相比傳統(tǒng)的粗放的方式具有更高的效率。

磁分離技術(shù)是一種在生物分析領(lǐng)域常用的利用納米材料集成生物放大策略的方式。 磁分離技術(shù)往往將識(shí)別元件組裝到磁性納米顆粒表面，可以很方便地將樣品中的目標(biāo)組分從干擾基質(zhì)中分離出來(lái)，并實(shí)現(xiàn)濃縮，從而提高分析檢測(cè)的靈敏度。 Zhou 等將一抗修飾在磁珠 （Fe3O4-Au）上， 將二抗上標(biāo)記量子點(diǎn)功能化的納米復(fù)合物（CdS-Au）， 構(gòu)建了基于磁分離技術(shù)的ECL 免疫傳感器檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）[30]。目標(biāo)物AFP 通過(guò)夾心免疫反應(yīng)將二抗標(biāo)記物裝配到磁珠上，在磁場(chǎng)的作用下， 磁珠被富集到電極界面進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度得到提高。 具體過(guò)程如圖17 所示。

圖17 基于磁分離技術(shù)的免疫傳奇構(gòu)建示意圖Fig．17 Scheme of the preparation procedures of the immunosensor．Copyright 2012 Elsvier

催化膽堿氧化， 伴隨著過(guò)氧化氫的生成，生成的過(guò)氧化氫馬上被Pt＠AuNFs 模擬過(guò)氧化物酶催化分解產(chǎn)生活性中間體，從而極大地增強(qiáng)魯米諾的ECL 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。 通過(guò)在納米材料表面修飾各種生物酶或模擬酶，可以將酶催化信號(hào)放大集成到納米材料表面進(jìn)行，酶催化原位生成的共反應(yīng)試劑相比直接加入的共反應(yīng)試劑具有更高的能量，反應(yīng)活性更強(qiáng)；同時(shí)，由于ECL發(fā)光試劑也被修飾在納米材料表面，從而使活性共反應(yīng)試劑與ECL 發(fā)光試劑被限定在較小的空間內(nèi)，發(fā)生反應(yīng)的效率更高。 Zhou 等在以ECL 試劑魯米諾作為還原劑制備的花狀的Pt＠Au 納米合金材料（Pt＠AuNFs）表面修飾固載膽堿氧化酶（ChOx），構(gòu)建集成了酶催化信號(hào)放大策略的納米復(fù)合物，以此為二抗標(biāo)記物制得了檢測(cè)心肌肌鈣蛋白（cTnI）的夾心型ECL 免疫傳感器[31]。在含有膽堿的電解質(zhì)溶液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，膽堿氧化酶催化膽堿氧化，伴隨著過(guò)氧化氫的生成，生成的過(guò)氧化氫馬上被Pt＠AuNFs 模擬過(guò)氧化物酶催化分解產(chǎn)生活性中間體，從而極大地增強(qiáng)魯米諾的ECL 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大（如圖18 所示）。

圖18 以ECL 試劑魯米諾作為還原劑制備的花狀的Pt＠Au 納米合金材料并以該材料為基礎(chǔ)構(gòu)建的ECL免疫傳感器的原理圖Fig．18 The schematic diagrams of(A)show the preparation of Ab2/luminol-Pt＠AuNFs/ChOx probes(Ab2 bioconjugates),(B)reveal the mechanism of the multiple signal amplification strategy and the comparative ECL signals with the target and without the target,and(C)exhibit preparation of MnO2＠MWNTs,then(I)display the structure of the luminol molecule,(II)and(III)display the SEM images of luminol-AuNFs and luminol-Pt＠AuNFs,respectively．Copyright 2014 RSC

除了酶催化信號(hào)放大策略之外，核酸信號(hào)放大策略是另一類重要的信號(hào)放大手段。 核酸信號(hào)放大策略可以將少量的目標(biāo)核酸分子轉(zhuǎn)化為數(shù)萬(wàn)倍的核酸分子響應(yīng)， 有效提高分析靈敏度，因此，快速、靈敏、適用性好的核酸信號(hào)放大策略是構(gòu)建決定ECL 生物傳感器性能的關(guān)鍵之一。傳統(tǒng)的ECL 生物傳感器中，核酸信號(hào)放大策略往往在電極界面執(zhí)行，這種異相反應(yīng)給生物大分子（核酸，蛋白等）之間的相互作用造成了很大的阻力，信號(hào)放大效率往往要打折扣。 因此，近幾年，受到傳感器微型化潮流的引導(dǎo)，更重要的是得益于等溫核酸信號(hào)放大技術(shù)的逐漸發(fā)展成熟，將復(fù)雜的核酸信號(hào)放大策略集成到單個(gè)納米材料表面構(gòu)成DNA 納米機(jī)器成為ECL 生物傳感器領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。Jiang 等將適體識(shí)別觸發(fā)的催化發(fā)夾組裝策略集成到具有催化活性納米材料（CoFe2O4＠Au）上，構(gòu)建了DNA 納米機(jī)器，實(shí)現(xiàn)了黏蛋白（MUC1）的ECL 超靈敏檢測(cè)[32]。 MUC1 與適體的特異性識(shí)別使發(fā)夾型的適體被打開(kāi)，從而引發(fā)兩個(gè)發(fā)夾型DNA 的自組裝， 是標(biāo)記有ECL信號(hào)分子（ABEI）的ABEI-H2組裝到納米顆粒表面，最后通過(guò)DNA 雜交，該納米復(fù)合物組裝到電極表面檢測(cè)ECL信號(hào)，CoFe2O4＠Au 能夠催化H2O2生成活性O(shè)H·增強(qiáng)ABEI 的ECL 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)DNA 自組裝和催化雙重信號(hào)放大。具體過(guò)程如圖19 所示。

圖19 (A)3-D DNA 機(jī)器的工作機(jī)理；(B)ECL 生物傳感器的構(gòu)建示意圖Fig．19 (A)Assembly Process of 3-D DNA Nanomachine Signal Probe Induced by Protein-Aptamer Binding Complex;(B)Schematic Diagrams of the Construction and the Luminescence Reaction Mechanism of the Biosensor．Copyright 2017 ACS

3 納米材料用于固載ECL 發(fā)光體

為了提高ECL 發(fā)光體的發(fā)光性能，縮短電子傳輸距離一直是研究者們所致力于的事情，這就需要將ECL 發(fā)光體固載到電極表面。那么如何實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的ECL 發(fā)光體固載就成為研究的中心點(diǎn)，除了少數(shù)ECL 發(fā)光體的成膜性好而可以直接滴涂在電極表面，采用納米材料作為載體固載ECL 發(fā)光體則成為了常用的手段。 目前比較常見(jiàn)的納米材料載體有以下幾類：納米碳材料、貴金屬納米材料、半導(dǎo)體納米材料。

納米碳材料是納米材料中極其重要的一類，其穩(wěn)定性好， 比表面積大及來(lái)源豐富等優(yōu)點(diǎn)，因而備受關(guān)注。 Ke 等利用介孔碳納米球的大的比表面積，借助Nafion，通過(guò)物理吸附作用實(shí)現(xiàn)了大量的ECL 發(fā)光體Ru(bpy)32+的固載[33]。 此外，結(jié)合貴金屬納米材料作為載體不僅能夠提高ECL發(fā)光體的固載量，還可以利用其導(dǎo)電性好、具有催化活性等優(yōu)點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)發(fā)光體的ECL 性能。 Hu等以N-摻雜的碳納米管（NCNTs）為載體,用乙二醇(EG)作為溶劑，加入H2PtCl6/EG 和RuCl3/EG混合均勻后加入NaOH/EG, 以微波照射的方式獲得具有電催化活性的Pt-Ru/NCNT 復(fù)合物[34]（圖20）。

圖20 固載策略的示意圖及夾心型ECL 適體傳感器的構(gòu)建Fig．20 Representative illustration of design strategy and fabrication process of the sandwiched magnetic ECL aptasensor．Copyright 2018 Elsvier

貴金屬納米材料是指Au、Ag、Pt 等一類的納米級(jí)材料， 它們可以與多種基團(tuán)結(jié)合， 占據(jù)了ECL 領(lǐng)域的半壁江山。 對(duì)魯米諾ECL 體系而言，因其酰肼結(jié)構(gòu)上的氨基活性低而使它的固載成為難題。 早期，崔華老師課題組以魯米諾直接作為還原劑，采用水熱法直接還原氯金酸得到金納米粒子（AuNPs），因此魯米諾就吸附在表面形成Au＠luminol NPs，實(shí)現(xiàn)了對(duì)魯米諾的固載。 Qu 課題組首先以蠟燭煙灰為原料，加入硝酸回流制得熒光碳點(diǎn)，此碳點(diǎn)表面富有羧基；隨后將其固載于Ag 納米粒子表面，形成CDs＠Ag 復(fù)合物，再把復(fù)合物與PAH 包裹的石墨烯片結(jié)合而實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)的成功固載[35]（圖21）。

圖21 以CDs＠Ag 為信號(hào)物的ECL 傳感器的原理圖解Fig．21 Illustration of the fabrication of a label-free electrochemiluminescent cytosensor．Copyright 2013 RSC

作為魯米諾的衍生物，ABEI 上的氨基具有相對(duì)高的活性， 能夠與很多官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，易于固載。 Shu 等合成了5,10,15,20-四(4- 羧基苯基)-卟啉(TCPP)修飾的二氧化鈦納米顆粒（TiO2nanoparticles），該納米粒子表面帶有羧基，可以與ABEI 在交聯(lián)劑的作用下發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ABEI 的固載[36]（圖22）。

圖22 (a)TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores 的制備過(guò)程；（b）TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores 的透射電鏡圖；（c）紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig．22 (a)Schematic illustration for fabrication of TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores．(b)TEM image of TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores．(c)UV-vis absorption spectra of TiO2 nanoparticles,ABEI,TCPP,TiO2-TCPP nanocomposites,and TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores．Copyright 2017 ACS

4 納米材料用以界面修飾

因電極的表面積有限，為提高ECL 發(fā)光體在電極上的固載量，研究者們常常會(huì)在電極界面修飾具有大比表面積、導(dǎo)電性能好的納米材料。

片層碳材料具有成膜性好的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)常用于界面修飾。 但單純的碳材料對(duì)ECL 的貢獻(xiàn)不大，因此與其他納米材料的結(jié)合，尤其是一些對(duì)ECL體系有一定催化作用的納米材料就格外受青睞。Chen 等在片層的碳氮化合物(CNNS)表面修飾金納米離子，形成CNNS＠AuNPs 復(fù)合物，然后將該復(fù)合物用于界面修飾，可以增強(qiáng)催化性能，為后續(xù)修飾提供基石[37]。 Rashidiani 等先合成了Si-Au NPs，再將其與表面巰基包裹的GO 結(jié)合在一起，形成tGO-Si-Au NPs 復(fù)合物，最后把它滴涂在電極界面上，起到固載第一抗體和促進(jìn)luminol ECL體系的作用[38（圖23、24）。

圖23 夾心型CNNS ECL 生物傳感器的組裝過(guò)程示意圖Fig．23 Procedures of assembling the sandwiched CNNS ECL biosensor and the control for evaluating the Dam MTase activity．Copyright 2018 ACS

圖24 制備的免疫傳感器的組裝過(guò)程示意圖Fig．24 Schematic illustration of proposed immunosensor in approaches 1 and 2．Copyright 2018 Elsvier

納米線結(jié)構(gòu)的納米材料是另外一種重要的界面修飾材料。 Wang 等將半胱氨酸溶液加入到新制的硝酸銀溶液中， 通過(guò)適當(dāng)升溫合成了銀-半胱氨酸納米線(AgCys NWs)，然后把AgCys NWs用于固載一抗[39]。 除了單金屬納米線以外，雙金屬合金納米線也是界面修飾載體之一。 Fu 等在N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入氯鉑酸、氯金酸和氫氧化鈉溶液， 通過(guò)高壓反應(yīng)釜合成了金-鉑納米線Au-Pt NWs。 然后將其與半胱氨酸及hemin修飾的還原石墨烯復(fù)合物（rGO-H-Cys）反應(yīng)后的復(fù)合物作為界面修飾的納米材料[40]（圖25、26）。

圖25 (A)二抗耦合物制備圖解;（B）ECL 信號(hào)增強(qiáng)機(jī)制；（c）AgCys Nanowires 制備Fig．25 Schematic Illustration of(A)Synthesis Process of Ab2-GOD＠Ce:ZONFs-Lum Signal Probe;(B)Possible ECL Mechanism of Signal Generation and Enhancement;(C)Preparation Process of the AgCys Nanowires．Copyright 2016 ACS

圖26 (A)界面修飾材料制備過(guò)程示意圖;（B）檢測(cè)D-Ala 的ECL 傳感器組裝過(guò)程圖Fig．26 (A)The preparation process for the rGO-H-Cys composite．(B)Schematic of the stepwise fabrication of the biosensor for ECL detection of D-Ala．Copyright 2018 RSC

5 結(jié)論與展望

標(biāo)志物電化學(xué)傳感是多學(xué)科交叉和發(fā)展的產(chǎn)物，它融匯了生命科學(xué)、分析化學(xué)、納米技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域的特點(diǎn)，具有成本低廉、靈敏度高、響應(yīng)速度快、易于微型化等優(yōu)點(diǎn)，在疾病標(biāo)志物的分析檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用。 近年來(lái)多種生物技術(shù)以及納米材料相繼興起并飛速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究人員構(gòu)建了系列的電化學(xué)生物傳感器，為其在各方面的應(yīng)用提供了前所未有的機(jī)遇。 同時(shí)，21 世紀(jì)是生物經(jīng)濟(jì)時(shí)代，作為生物技術(shù)支撐之一的生物傳感器迎來(lái)了新的發(fā)展機(jī)遇。 隨著材料、電子信息與生物科學(xué)等領(lǐng)域不斷進(jìn)步， 分析化學(xué)家、生物學(xué)家、工程師和醫(yī)療專業(yè)人員之間的密切合作必將為電化學(xué)傳感進(jìn)一步發(fā)展提供更廣闊的空間。