胡椒堿對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

邵憶閔,吳 湧

邵憶閔,桐廬縣中醫(yī)院藥劑科 浙江省杭州市 311500

吳湧,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部 浙江省杭州市 310006

0 引言

結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的腸道惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì),且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[1].我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率已躍居所有惡性腫瘤前5位[2].腫瘤切除術(shù)后輔以化療仍然是治療結(jié)直腸癌的主要手段,但由于臨床常用的化療藥物常具有較高的毒副作用,從而嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[3,4].因此,迫切需要尋找新型高效低毒的藥物來(lái)替代常用的化療藥物.天然生藥提取物因具有豐富的藥理活性以及毒性小的特點(diǎn),其在腫瘤治療方面可能具有良好的應(yīng)用前景[5].胡椒堿(piperine,PIP)是一種從黑胡椒中提取的生物堿類(lèi)活性化合物,其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和促進(jìn)藥物代謝等多種藥理活性[6-8].雖然,目前關(guān)于PIP的抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行了一些相關(guān)的基礎(chǔ)研究[6,7],但其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的具體生物學(xué)功能及機(jī)制的研究并不完善.因此,本研究選用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞作為研究對(duì)象,旨在探究PIP對(duì)SW480細(xì)胞細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響以及潛在的生物學(xué)機(jī)制,以評(píng)估其作為潛在的抗結(jié)腸癌候選藥物的可能性.

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù),人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系FHC購(gòu)于美國(guó)典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC) 細(xì)胞庫(kù),人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系NCM460購(gòu)于通派(上海)生物科技有限公司.改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco,DMEM)、L-15培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自Gibco公司;PIP(純度＞98%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)試劑購(gòu)自Sigma公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒、5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)試劑盒、β-肌動(dòng)蛋白(beta-Actin,β-Actin)抗體以及辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;Ⅱ型微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)抗體購(gòu)自Abcam公司;LC3、p53、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 (B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白 (Bcl-2 associated X protein,Bax)、劈裂的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine aspartate proteinase-3,Cleaved caspase 3)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與溶液制備:將SW480和HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS,100 μU/mL青霉素-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中,FHC和NCM460細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS,100 μU/mL青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,上述細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 C C K-8法檢測(cè)細(xì)胞活性:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480、HT-29、FHC和NCM460細(xì)胞用胰蛋白酶消化后將其接種在96孔板中(5×103細(xì)胞/孔)每孔做3個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后,分別用不同濃度的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理細(xì)胞24 h,用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,并在37 ℃孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值A(chǔ).細(xì)胞活性=(A實(shí)驗(yàn)組-A對(duì)照組)/A對(duì)照組×100%.

1.2.3 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞用胰蛋白酶消化后將其接種在96孔板中(5.0×103細(xì)胞/孔)每孔做3個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后,分別用不同濃度的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理細(xì)胞24 h.每孔加入50 μM EdU試劑,并在37 ℃孵育2 h,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,對(duì)細(xì)胞固定和透化后,每孔加入100 μL Appollo?567染色反應(yīng)液避光孵育30 min,然后用DAPI染核.在熒光顯微鏡下觀察,隨機(jī)視野拍照并對(duì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù).

1.2.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲:用24孔Transwell小室(聚碳酸酯膜,8 μm孔徑)檢測(cè)細(xì)胞的遷移以及侵襲.收集已被0、5、10、20 μg/mL PIP處理24 h的SW480細(xì)胞,并將其用無(wú)血清培養(yǎng)基制成2.0×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液.進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí),Transwell板上室內(nèi)膜表面鋪有Matrigel基質(zhì)膠,并取100 μL細(xì)胞懸液加入上室,在下室中加入700 μL含10%FBS的培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)24 h.

遷移實(shí)驗(yàn)除了不進(jìn)行鋪Matrigel基質(zhì)膠外,其他步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn).用棉簽擦除聚碳酸酯膜上表面的細(xì)胞,并將膜下表面的細(xì)胞用甲醇固定5 min后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min.用倒置相差顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野的細(xì)胞圖像,并對(duì)染色的細(xì)胞計(jì)數(shù).

1.2.5 LC3Ⅱ免疫熒光染色:將SW480細(xì)胞接種在24孔板(2.0×105個(gè)/孔),用不同濃度PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理24 h后,收集細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定20 min,然后在室溫下用Triton X-100透化15 min.用5%BSA封閉細(xì)胞30 min,然后室溫孵育LC3Ⅱ(1:300)2 h.用PBS洗滌細(xì)胞后,室溫孵育熒光標(biāo)記的二抗(1:300)1 h.再次用PBS洗滌后,用DAPI染核,并在熒光顯微鏡下觀察.

1.2.6 Western blot:收集已被0、5、10、20 μg/mL PIP處理24 h的SW480細(xì)胞,并用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞分離得到總蛋白.用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度.將等量蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.用5%脫脂牛奶封閉2 h后,分別4 ℃孵育一抗LC3、p53、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase 3(均1:1000稀釋比例)和β-Actin(1:5000稀釋比例)過(guò)夜,經(jīng)TBS洗滌3次后,室溫孵育1:2000稀釋比例的HRP特異性標(biāo)記的二抗2 h,最后使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑對(duì)條帶顯影.使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以mean±SD表示,并應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析,多重比較使用Tukey法.以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PIP抑制SW480和HT-29細(xì)胞的細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其發(fā)生形態(tài)異常 用濃度梯度遞增的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理SW480和HT-29細(xì)胞24 h,CCK-8結(jié)果表明,PIP處理的細(xì)胞活性顯著降低并呈劑量依賴(lài)性(圖1A、B),且在PIP濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)效果最顯著.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明,PIP處理后的SW480細(xì)胞形態(tài)萎縮變圓,且隨著濃度增加,細(xì)胞密度也逐漸降低(圖1C),同樣,當(dāng)PIP濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞碎片和形態(tài)學(xué)改變.另外,在(5、10和20 μg/mL)劑量下的PIP對(duì)人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系FHC和NCM460的細(xì)胞活性沒(méi)有影響(圖2),提示在該劑量下PIP對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒.由此可見(jiàn),PIP能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡.

圖1 PIP對(duì)SW480和HT29細(xì)胞的細(xì)胞活性和細(xì)胞形態(tài)的影響.A和B:CCK-8檢測(cè)各組SW480(A)和HT-29(B)細(xì)胞的細(xì)胞活性;C:倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài).n=3,aP＜0.01,bP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

圖2 PIP對(duì)FHC和NCM460細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響.A和B:CCK-8檢測(cè)各組FHC(A)和NCM460(B)細(xì)胞的細(xì)胞活性.n=3.PIP:胡椒堿.

2.2 PIP抑制SW480細(xì)胞的增殖 用濃度梯度遞增的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理SW480細(xì)胞24 h,EdU染色(圖3)結(jié)果顯示,隨著PIP濃度逐漸升高,EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸降低,提示SW480細(xì)胞增殖逐漸降低,且PIP在濃度為20 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最為明顯.

圖3 PIP對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響.A:各組細(xì)胞代表性的EdU染色圖;B:各組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.n=3,aP＜0.05,bP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

2.3 PIP抑制SW480細(xì)胞遷移和侵襲 Transwell結(jié)果(圖4)顯示,隨著PIP濃度的升高,細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力均呈濃度依賴(lài)性減弱,且PIP在濃度為20 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用最為明顯.

圖4 PIP對(duì)SW480細(xì)胞的遷移和侵襲的影響. A:各組細(xì)胞代表性的遷移與侵襲圖(Transwell法,結(jié)晶紫染色,比例尺=200 μm).B:細(xì)胞遷移的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C:細(xì)胞侵襲的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.n=3,aP＜0.01,bP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

2.4 PIP誘導(dǎo)SW480細(xì)胞自噬并上調(diào)p53信號(hào)通路LC3Ⅱ的免疫熒光染色結(jié)果(圖5A)顯示,PIP能誘導(dǎo)SW480細(xì)胞自噬.Western blot結(jié)果(圖5B-G)顯示,隨PIP濃度升高,SW480細(xì)胞中p53、Bax和Cleaved caspase 3表達(dá)以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值逐漸增加,Bcl-2表達(dá)逐漸降低.以上結(jié)果說(shuō)明,PIP能誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡并上調(diào)p53信號(hào).

圖5 PIP對(duì)SW480細(xì)胞的自噬以及p53信號(hào)通路的影響.A:各組細(xì)胞代表性的LC3Ⅱ免疫熒光染色圖;B:各組細(xì)胞代表性的p53、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3以及LC3蛋白表達(dá)的Western blot條帶圖;C:p53相對(duì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;D:Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;E:Bax相對(duì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;F:Cleaved caspase 3相對(duì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;G:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.n=3,aP＜0.01,bP＜0.01,cP＜0.01,dP＜0.05,eP＜0.01,fP＜0.01,gP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

3 討論

結(jié)腸癌是臨床中十分常見(jiàn)的一種發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤性疾病[1,2],據(jù)報(bào)道,全球每年約新增120萬(wàn)例,且每年約60萬(wàn)例因結(jié)腸癌而死亡[9].目前手術(shù)切除輔以術(shù)后化療是結(jié)腸癌治療中的最常用策略,但隨著化療時(shí)間的延長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低,造成患者對(duì)化療藥物耐藥性的產(chǎn)生從而阻礙治療進(jìn)程[3].因我國(guó)傳統(tǒng)中藥具有藥理活性豐富、治療靶點(diǎn)多、且毒副作用相對(duì)較低的特性,其在腫瘤治療方面的應(yīng)用中也受到越來(lái)越多的關(guān)注[5].從眾多傳統(tǒng)中藥中篩選具有高活性的抗腫瘤小分子可能會(huì)成為篩選新型抗癌藥物的潛在途徑.PIP作為一種從黑胡椒內(nèi)提取的具有天然活性的生物堿,其已被一些臨床前研究證明具有抗腫瘤活性[6,7].本研究顯示,PIP能抑制SW480細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,提示其有望成為抗結(jié)腸癌的潛在的替代藥物.

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的自噬異常存在密切的關(guān)系[10,11].適度自噬可作為實(shí)體腫瘤細(xì)胞在對(duì)抗缺氧缺營(yíng)養(yǎng)的不利條件下而發(fā)揮促生存的一種保護(hù)機(jī)制,但過(guò)度自噬則會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的活性、增殖、遷移與侵襲并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12].研究表明,伊立替康、奧沙利鉑和5-FU等常見(jiàn)的化療藥物均能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞自噬性死亡[13,14].因此,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬性死亡已經(jīng)成為潛在的抗結(jié)腸癌治療策略之一.故本研究探索PIP對(duì)SW480細(xì)胞自噬的影響,結(jié)果顯示,PIP能增強(qiáng)SW480細(xì)胞的LC3Ⅱ的免疫熒光強(qiáng)度并增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Cleaved caspase 3表達(dá),說(shuō)明PIP能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡,提示PIP的抗結(jié)腸癌的作用至少部分與其誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡相關(guān).

本研究繼續(xù)對(duì)PIP的抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制進(jìn)行了探索.已有研究表明,p53可通過(guò)上調(diào)下游基因p21表達(dá)導(dǎo)致G1期阻滯[15]和下調(diào)Cyclin B1導(dǎo)致G2/M期阻滯[16],從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖;p53也可通過(guò)上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)來(lái)達(dá)到促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用[17].另外,p53能通過(guò)下游多信號(hào)通路來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與侵襲[18,19].本研究發(fā)現(xiàn),PIP能濃度依賴(lài)性抑制SW480增殖、遷移與侵襲的同時(shí)伴隨著上調(diào)p53、Bax和Cleaved Caspase 3表達(dá)并下調(diào)Bcl-2的表達(dá),提示PIP抑制細(xì)胞增殖、遷移與侵襲可能在一定程度上與其上調(diào)p53信號(hào)通路相關(guān).而p53與細(xì)胞自噬的關(guān)系相對(duì)復(fù)雜,一方面核p53可通過(guò)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用促進(jìn)細(xì)胞自噬[20],另一方面漿p53以轉(zhuǎn)錄活性非依賴(lài)性抑制自噬[21].此外,一些毒性應(yīng)激(比如某些化療藥物)和氧化應(yīng)激刺激時(shí),結(jié)腸癌細(xì)胞自噬也可不依賴(lài)p53發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[13].因此,PIP誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡是否通過(guò)p53信號(hào)仍需進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

總之,本研究目前結(jié)果顯示,PIP能抑制SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)SW480細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡和上調(diào)p53信號(hào)通路相關(guān).本研究結(jié)果還提示,PIP是潛在的結(jié)腸癌治療劑.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

由于常用的化療藥物具有較高的毒副作用,且易產(chǎn)生化療耐藥,造成目前結(jié)腸癌患者的化療效果并不太理想.因此,尋找新型高效低毒的結(jié)腸癌化療替代藥物顯得尤為迫切.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

據(jù)最近研究顯示胡椒堿(piperine,PIP)在多種腫瘤中具有抗癌作用,但其在結(jié)腸癌的作用和機(jī)制的評(píng)估尚不完善.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討PIP是否具有抗結(jié)腸癌的作用.

實(shí)驗(yàn)方法

分別通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)法、5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色法和Transwell法檢測(cè)PIP對(duì)SW480細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲的影響,并用免疫熒光法和蛋白質(zhì)免疫印跡法分析其潛在的機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PIP在0-20 μg/mL濃度范圍內(nèi)能以劑量依賴(lài)性方式抑制SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并上調(diào)細(xì)胞中p53表達(dá)和誘導(dǎo)其自噬性死亡相關(guān).另外,在此劑量范圍內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞無(wú)毒性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

PIP具有抗結(jié)腸癌的作用,這一作用體現(xiàn)在PIP能抑制結(jié)腸癌增殖、遷移和侵襲并能誘導(dǎo)其自噬性死亡.

展望前景

PIP是潛在的結(jié)腸癌常用化療藥的替代藥物.