飼用黃絲藻粉對大鼠兩代繁殖毒性及致畸試驗

肖金吒 ，陳玢霖 ，王存凱 ，周志強 ，劉 娟 ，陳 新 ，2，丁麗軍 ，張雨梅 ，2*

（1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009；3. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

黃絲藻為黃藻綱、黃絲藻屬藻類，多在淡水環(huán)境中生長。在27 種黃絲藻屬中，我國有16 種及2 個變種[1]。黃絲藻是一種節(jié)狀不分支絲狀微藻，單節(jié)細(xì)胞長7~20 μm、寬3~1.5 μm，藻絲長度為0.5~3.0 mm[2]。目前，已有關(guān)于藻粉或藻粉提取物作為飼料成分或飼料添加劑的報道[3-4]。研究和應(yīng)用較多的藻類主要有螺旋藻、小球藻、雨生紅球藻和杜氏鹽藻[5-6]。對黃絲藻的研究大多為生態(tài)治理方面，而對其資源化利用的報道相對較少。黃絲藻油脂含量高、代謝產(chǎn)物豐富、易采收，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益。研究顯示，囊狀黃絲藻脂肪酸包括豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸（EPA）等，其中棕櫚油酸的含量最高[7]。黃絲藻脂肪酸組分中EPA 可占細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸含量的11.97%[8]。在14 種微藻研究中，黃絲藻綱代表種異膠藻脂肪酸組成以EPA 為主，高達(dá) 31.96%，居所測微藻之首，棕櫚酸（16∶0）和（16∶1）（n-7）含量也較豐富，PUFAs（n-3）的含量達(dá)32.93%[9]。黃絲藻ENN172 在優(yōu)化培養(yǎng)6 d 后脂肪酸含量可達(dá)27.03%[10]，優(yōu)化條件培養(yǎng)后的生物量提高32.73%，油脂產(chǎn)率提高16.74%，其脂肪酸產(chǎn)量仍具有很大的提升空間，有望成為微藻產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的潛力藻株。利用GC-MS 方法可檢測到黃絲藻不同提取成分中含有9 種氨基酸、17 種有機酸、12 種糖類和 2 種醇[11-12]。收獲微藻的成本一般占微藻類產(chǎn)品總成本約20%~30%[13]。小球藻屬、柵藻屬和杜氏鹽藻屬等單細(xì)胞微藻在培養(yǎng)或生產(chǎn)中較難收獲，容易被原生動物吞食[14-15]。黃絲藻的特殊絲狀體結(jié)構(gòu)使其具有抵抗輪蟲等原生動物和浮游動物吞食的能力，有助于微藻細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)采收[16-17]。通過預(yù)處理的高活性黃絲藻藻種，降低其水分活度及含水量，在0 ℃密封環(huán)境中經(jīng)36 h 長途運輸過后，藻種活性達(dá)90%以上，脂肪酸、蛋白及多糖含量基本維持不變[18]。本研究中的黃絲藻粉為生產(chǎn)生物柴油后的廢棄黃絲藻體，經(jīng)適當(dāng)處理后得到的藻粉。該藻粉中除了含有較多的粗蛋白、脂肪外，還含有較高水平的EPA。

研究通過對大鼠的兩代繁殖毒性及致畸性試驗，考察黃絲藻粉較大劑量、較長時間添加于飼料后對大鼠可能存在的不良反應(yīng)，以期評估作為飼料應(yīng)用的安全性，可為黃絲藻粉作為飼用產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃絲藻粉購自河北新奧生物技術(shù)公司（批號20180406），為草綠色粉末。粗蛋白含量37.2%、粗脂肪含量6.4%、EPA 含量1.46%。黃絲藻粉經(jīng)粉碎后，過150 目篩，4 ℃密封保存?zhèn)溆?。小鼠LD50≥5 000 mg/kg BW[18]。

試驗Wistar 大鼠（清潔級）公、母各半，4 w，同性別體重差異不超過20%，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。大鼠飼喂經(jīng)60Co照射飼料，自由采食和飲水。試驗前在實驗動物房環(huán)境中適應(yīng)5 d。

黃絲藻粉以10%、5%和2%添加至飼料中，由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物有限公司加工制成飼料。

1.2 試驗設(shè)計

黃絲藻粉以高、中、低劑量經(jīng)飼料給予。對照組大鼠飼喂常規(guī)大鼠飼料，試驗組飼喂含有10%、5%和2%的黃絲藻粉飼料。每組公鼠20 只、母鼠22 只。親代及斷乳子代接受的黃絲藻粉劑量相同，子代在斷乳后給予。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 大鼠繁殖性能

在黃絲藻粉給予10 w后，按1∶1的比例隨機選擇雌鼠和雄鼠合籠交配，次日晨檢查陰道栓，以見栓標(biāo)記為受孕第0 d。受孕鼠分籠飼養(yǎng)，繼續(xù)飼喂各組飼料。孕鼠的體重持續(xù)增加，則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常。每組10只孕鼠待自然分娩后，記錄每窩的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、死仔數(shù)、性別，計算生活仔率、出生存活率和哺乳存活率。按以下公式計算每組的受孕率、妊娠率、出生活仔率、出生存活率和哺乳存活率。

1.3.2 新生鼠的生長性能

新生鼠斷奶后分為兩部分，第一部分從每窩中隨機抽出公、母鼠各2 只，使每組公、母鼠各20 只，飼喂相應(yīng)劑量組飼料10 W 后，按1.3.1 中方法進(jìn)行交配產(chǎn)生孕鼠。第二部分從每窩仔鼠中隨機選出公、母鼠各1只，使每組公、母鼠分別10只，飼喂正常飼料，每周稱量體重和飼料消耗，用于新生鼠生長情況的觀察。

1.3.3 大鼠臟器與胎鼠畸形檢測

在受孕第20 d，每組處死6~8 只F0 孕鼠，稱量主要臟器。同時剖檢公鼠，計算臟器系數(shù)。孕鼠剖檢時，取出整個子宮稱取窩重，并分別稱量胎盤重，計數(shù)活產(chǎn)幼仔數(shù)、死胎以及吸收胎數(shù)。檢查活產(chǎn)胎仔的性別，測量每仔的體長、體重和尾長，并按窩計算平均體重、體長和尾長。對胎鼠進(jìn)行外觀畸形、內(nèi)臟畸形和骨骼畸形檢查。分別按以下公式計算畸胎率、活胎仔平均畸形率、母體畸胎率、死胎率及吸收胎率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0進(jìn)行t檢驗或χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃絲藻粉對大鼠繁殖性能的影響（見表1）

表1 黃絲藻粉對大鼠繁殖性能的影響Tab.1 Effect of Tribonema powder on reproductive performance of rats

由表1可知，與對照組相比，黃絲藻粉組妊娠率、受孕率、總仔數(shù)、出生活仔率、出生存活率、哺乳存活率及性別比均無顯著差異（P>0.05）。

2.2 黃絲藻粉對F1、F2 代大鼠的生長性能的影響（見圖1、圖2）

圖1 黃絲藻粉對F1、F2代大鼠體重的影響Fig.1 The effect of Tribonema powder on the body weight of F1 and F2 generation rats

由圖1可知，黃絲藻粉低、中劑量組大鼠體重與對照組相當(dāng)，高劑量組F1、F2 代大鼠體重稍低，但差異不顯著（P>0.05）。由圖2 可知，黃絲藻粉組大鼠采食量與對照組無顯著差異（P>0.05）。

2.3 黃絲藻粉對大鼠臟器與胎鼠畸形的影響（見表2~表4、圖3）

由表2可知，除中劑量黃絲藻粉組F2腎系數(shù)顯著低于對照外（P<0.05），其余各劑量黃絲藻粉組肝、腎、脾、子宮、卵巢及睪丸的臟器系數(shù)與對照組相比均無顯著差異（P>0.05）。

圖2 黃絲藻粉對F1、F2代大鼠采食量的影響Fig.2 The effect of Tribonema powder on the feed intake of F1 and F2 generation rats

由表3可知，與對照組相比，黃絲藻粉3個劑量組的窩重、窩仔數(shù)、胎盤重、胎仔體重、體長、尾長及性別比無顯著差異（P>0.05）。

由表4可知，F(xiàn)1代胎鼠畸形檢查中僅發(fā)現(xiàn)胸骨骨節(jié)有缺失（或發(fā)育不全）現(xiàn)象，未見其他畸形。黃絲藻粉不同劑量組的畸形率、畸胎率等指標(biāo)，與對照組無顯著差異（P>0.05）。F2代胎鼠畸形檢查中，黃絲藻粉不同劑量組及對照組，均未見外觀畸形及內(nèi)臟畸形。

由圖3可知，骨骼畸形檢查中對照組、高劑量和低劑量組，均發(fā)現(xiàn)在第7~12肋骨延長線上有紅色染色，但與肋骨分離，胸骨節(jié)有缺失（或發(fā)育不全）現(xiàn)象。

表2 黃絲藻粉對F0、F1、F2大鼠臟器系數(shù)的影響Tab.2 Effect of Tribonema powder on organ coefficient of F0,F1,F2 rats 單位：%

表3 黃絲藻粉對F0、F1代母鼠剖檢情況的影響Tab.3 Effect of Tribonema powder on necropsy of F0 and F1 generation rats

表4 黃絲藻粉對F1、F2代胎鼠畸形的影響Tab.4 Effect of Tribonema powder on deformity of F1 and F2 generation rats

圖3 F2代胎鼠骨骼畸形Fig.3 Skeletal deformities of F2 fetal mice

3 討論

將藻類或其提取物作為飼料或者添加劑已經(jīng)有廣泛的報道，如螺旋藻[19]、小球藻、杜氏鹽藻等。對黃絲藻的研究大部分是在水體治理方面[20-21]，而在飼用方面的研究報道較少。黃絲藻油脂含量高、代謝產(chǎn)物豐富且易采收，有研究報道絲狀微藻黃絲藻是可以用于戶外培養(yǎng)的優(yōu)勢藻種[22]，在作為飼料成分或飼料添加劑方面具有良好的應(yīng)用前景。

兩代繁殖毒性試驗通過對親代和子一代兩代動物進(jìn)行染毒，除可獲得受試物對親代動物生殖系統(tǒng)和行為作用的一般性資料，同時還可提供新生仔疾病、死亡、出生前后發(fā)育毒性等方面的基礎(chǔ)資料[23]。本研究中，受試物黃絲藻粉各劑量組對F0、F1母鼠的繁殖能力、生產(chǎn)性能及對子代生長發(fā)育，均與正常對照組比較無顯著差異，說明受試物無明顯的繁殖毒性。對F1、F2 代胎鼠畸形檢查結(jié)果表示受試物各劑量組無外觀畸形和內(nèi)臟畸形，僅發(fā)現(xiàn)少量的骨骼畸形，且畸形率與正常對照組無顯著差異，說明受試物對大鼠無明顯的致畸作用。

本實驗室前期研究中，黃絲藻粉對大、小鼠的經(jīng)口急性毒性LD50>5 000 mg/kg，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）關(guān)于外源化學(xué)物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，受試物可歸為無毒級別物質(zhì)對黃絲藻粉的亞慢性毒性試驗表明，10%添加于飼料中給予大鼠90 d未發(fā)現(xiàn)有明顯的損害作用[24]。小鼠精子畸形試驗，黃絲藻粉致突變試驗結(jié)果為陰性，在體內(nèi)或體外、對生殖細(xì)胞或體細(xì)胞均無明顯的致突變作用。通過黃絲藻粉對大鼠的兩代繁殖毒性及致畸性試驗，評估其作為飼料應(yīng)用的安全性，可為黃絲藻粉作為飼用產(chǎn)品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，10%黃絲藻粉添加于飼料中，未對大鼠具有明顯的生殖毒性與致畸性。黃絲藻粉的毒理學(xué)評價結(jié)果符合相關(guān)的安全性評價要求，有望作為飼用新產(chǎn)品在動物飼料中應(yīng)用。