凝膠滲透色譜柱填料研究現(xiàn)狀

房志鵬，于 冰*，叢海林，劉虎威

(1.青島大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，材料科學(xué)與工程學(xué)院，生物醫(yī)用材料與工程研究院，山東 青島 266071；2.武昌理工學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223)

凝膠滲透色譜法(GPC)是19世紀(jì)60年代開(kāi)發(fā)的一種液相色譜分離技術(shù)。其分離基礎(chǔ)是溶液中溶質(zhì)分子的大小，溶質(zhì)分子的洗脫量(即保留在色譜柱中的量)主要取決于物理參數(shù)，如溶質(zhì)分子尺寸，不同填料的孔徑、孔隙率存在的差異，色譜柱體積以及流動(dòng)相和固定相之間相互作用的差異，而與樣品無(wú)關(guān)。因此，凝膠滲透色譜具有對(duì)流動(dòng)相的要求低、實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)穩(wěn)定、重現(xiàn)性高、分析速度快、溶質(zhì)回收率高等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法與其他方法相比具有更獨(dú)特的分離效果。由于其根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離，已得到迅速發(fā)展并在許多領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。GPC法作為一種工具，在聚合物分子量測(cè)定以及分子量分布的精確測(cè)定方面具有廣闊且更有前途的應(yīng)用前景。隨著液相色譜技術(shù)的發(fā)展，尤其是各種微孔高效凝膠填料的出現(xiàn)，GPC法越來(lái)越多地應(yīng)用于石油、藥物、生物以及食品等領(lǐng)域，多用于物質(zhì)組成分析以及對(duì)組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)特性分析等。近年來(lái)，作為一種樣品預(yù)處理技術(shù)，GPC也被廣泛用于生物、環(huán)境、醫(yī)學(xué)、食品等樣品的預(yù)處理、分離和純化[1-3]。

柱填料是GPC技術(shù)的核心關(guān)鍵，其應(yīng)用廣泛且對(duì)分離純化的結(jié)果起著決定作用。目前，基于凝膠的柱填料使用最為廣泛，例如聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚苯乙烯凝膠、瓊脂糖凝膠等。本文以上述填料為主，對(duì)凝膠滲透色譜柱填料的合成、性能和應(yīng)用進(jìn)行介紹。表1列出了此4種填料的主要制備方法及應(yīng)用。

表1 常用填料的制備方法及其應(yīng)用Table 1 Preparation and application of common fillers

1 聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺(PAM)凝膠是一種合成凝膠，由丙烯酰胺(AM)單體構(gòu)成，并以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。將其處理后形成顆粒。各種不同類(lèi)型凝膠的制備可通過(guò)控制交聯(lián)劑占反應(yīng)體系的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)，交聯(lián)劑越多，孔越小。其適用于蛋白質(zhì)[4-5]和多糖的純化。

聚丙烯酰胺微球又稱(chēng)聚丙烯酰胺微?；蚓郾０肺⒛z，是指丙烯酰胺單體的均聚物或與其他單體共聚形成的高分子微球[6]。作為一種功能微球材料，其具有良好的吸水及保水性能，此外還具有良好的生物相容性，在眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前，聚丙烯酰胺微球的主要制備方法為均相法和非均相法。常見(jiàn)的均相法有反相乳液聚合法和反相微乳液聚合法，產(chǎn)物大多呈膠乳或微膠乳形態(tài)；非均相法有分散聚合法、沉淀聚合法、反相懸浮聚合法等，產(chǎn)物一般呈固體微粒狀態(tài)。

Yao等[7]采用聚合誘導(dǎo)相分離法，制備得到多孔磁性聚丙烯酰胺微球，微球表面由于具有多孔結(jié)構(gòu)和磁性，對(duì)亞甲基藍(lán)(MB)具有較高的吸附效率。此外,微球?qū)为?dú)存在的中性紅和龍膽紫或兩者混合溶液也具有很高的吸附能力。該微球最少可重復(fù)使用6個(gè)循環(huán)，與目前已有的吸附劑相比，具有更好的吸附能力和更高的效率，在陽(yáng)離子染料吸附分離領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。Zou等[8]通過(guò)丙烯酰胺和海藻酸鈉的乳液聚合，制備了一種新型雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺/海藻酸鈉復(fù)合微球吸附劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)陽(yáng)離子染料MB的吸附。該復(fù)合微球包含大量均勻分布的中孔，孔徑分布為0～200 nm。引入海藻酸鈉(SA)后，PAM的熱穩(wěn)定性和結(jié)晶度雖略有下降，但MB的吸附容量顯著增加。

Wang等[9]合成了一種具有良好自發(fā)熒光的新型聚丙烯酰胺微球(fPAMMP)。通過(guò)原位聚合制備不同尺寸的低產(chǎn)率fPAMMP，利用反相微乳液聚合反應(yīng)合成了小尺寸的高產(chǎn)率fPAMMP。制備的fPAMMP具有可見(jiàn)熒光(VF)和近紅外熒光(NIRF)的強(qiáng)而穩(wěn)定的自發(fā)熒光，在各種嚴(yán)格條件下(如堿、酸和高溫)也具有很高的穩(wěn)定性。所制備的fPAMMP具有高正電荷，可用于有效捕獲鏈霉親和素和DNA等各種生物分子，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。

2 交聯(lián)葡聚糖凝膠

作為多糖大家族中的一員，葡聚糖(右旋糖酐)存在于某些微生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中排泄的黏液中，分子量較高，在輸血過(guò)程中可代替部分全血(稱(chēng)為代血漿)，在臨床上的應(yīng)用已有悠久歷史。軟性凝膠家族龐大且多樣，其中具有多孔性三度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)葡聚糖凝膠微球具有豐富的孔道，能吸入大量的溶劑。凝膠體積可在水中溶脹數(shù)倍且不會(huì)溶解?？讖椒秶煌?，其分離范圍也不同，在生物化學(xué)中被大量用于蛋白質(zhì)[10-11]、核酸、酶和多糖類(lèi)高分子物質(zhì)的分離,是分離純化生物大分子不可或缺的一類(lèi)介質(zhì)[12]。

交聯(lián)葡聚糖凝膠微球的制備過(guò)程并不復(fù)雜，首先選取葡聚糖單體作為原料，后加入交聯(lián)劑與單體發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，再經(jīng)后處理得到微球。葡聚糖具有奇特的膠凝特性，單體通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)后得到的交聯(lián)葡聚糖凝膠微球不但具備優(yōu)良的親水性，還具備良好的水不溶性以及吸水后溶脹的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的利用價(jià)值。另外作為層析凝膠介質(zhì)，其在分離純化方面也有著悠久的使用歷史，在其他領(lǐng)域也將有廣泛的應(yīng)用前景。就現(xiàn)階段而言，交聯(lián)葡聚糖凝膠微球的制備方法分為化學(xué)、物理和相分離法，其中通過(guò)化學(xué)法生產(chǎn)的微球仍占市場(chǎng)主流。

交聯(lián)葡聚糖凝膠微球常用的化學(xué)制備法是乳化交聯(lián)法和反相乳液聚合法。這兩種方法是預(yù)先將葡聚糖單體溶于氫氧化鈉溶液中構(gòu)成水相后，加入含有交聯(lián)劑的有機(jī)相中，經(jīng)攪拌使兩相充分乳化，向溶液中加入交聯(lián)劑以形成微球。物理法是將藥物通過(guò)設(shè)備作用使其在氣相中進(jìn)行微囊化的方法[13]。相分離法是通過(guò)改變混合溶液的溶解條件來(lái)降低聚合物在溶液中的溶解度，進(jìn)而使微球從溶液中沉淀[14]。

交聯(lián)葡聚糖凝膠微球作為一種具有較好生物相容性的藥物載體材料，不僅可提高藥物的穩(wěn)定性，對(duì)藥物起到緩釋作用[15-17]，還可作為環(huán)境敏感型分子的保護(hù)載體[18-19]和顯影劑使用[20]，未來(lái)有望用作傷口輔料[21]。本文著重介紹其在醫(yī)藥、凝膠層析、色譜分離、固相吸附及分析等領(lǐng)域的應(yīng)用[22]。

曾家豫等[23]利用型號(hào)分別為G-25、G-50、G-75、G-100、G-125的Sephadex層析柱，對(duì)纖維素酶粗酶液進(jìn)行分離。結(jié)果表明G-75具有良好的分離效果，其回收率可提高至41.6%，且與分離前相比，酶的比活力可提高4.9倍。張慧麗等[24]用Sephadex LH-20層析法對(duì)人參粗品進(jìn)行兩次分離純化，再用Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化得到人參皂苷Re，回收率為58.6%，純度為96.2%。該法簡(jiǎn)化了樣品處理過(guò)程，克服了層析柱中原介質(zhì)無(wú)法反復(fù)利用及再生繁瑣的弊端，具有省時(shí)、省力的優(yōu)點(diǎn)[25]。包建民等[26]采用反向懸浮聚合制備的交聯(lián)葡聚糖凝膠微球具有優(yōu)良的球形度、分散性、吸水溶脹和凝膠過(guò)濾分離性能，被用于對(duì)脂質(zhì)體與藥物進(jìn)行分析檢測(cè)。

由于交聯(lián)葡聚糖凝膠微球具有良好的生物相容性和可降解性，因此常被應(yīng)用于靶向應(yīng)用、栓塞治療、緩控釋?xiě)?yīng)用等[27]。在控釋方面，藥物可包裹在葡聚糖內(nèi)形成微小的球狀物，既能達(dá)成靶向的目標(biāo)，也能達(dá)成緩釋的目標(biāo)。Tomme等[28]將帶相反電荷的交聯(lián)葡聚糖凝膠微球混合分散，制得的凝膠主要應(yīng)用于藥物活性蛋白基體，適用于傳遞藥物以及組織工程等領(lǐng)域。

3 聚苯乙烯凝膠

聚苯乙烯是以苯乙烯單體作為反應(yīng)原料，選取不同的交聯(lián)劑通過(guò)一系列復(fù)雜的聚合反應(yīng)得到的聚合物。苯乙烯單體分子具有一定的毒性，但聚合反應(yīng)后得到的大分子聚苯乙烯無(wú)毒。相較于其它大分子，聚苯乙烯獲取方式及成本更低，機(jī)械性能更出色，具備良好的化學(xué)穩(wěn)定性以及更好的生物相容性[29]，在吸附領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用[30-32]。與其他凝膠相比，聚苯乙烯凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更大，因此用于分離分子量分布在1.6 k～40 000 k的生物大分子。聚苯乙烯還具有優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度，在手性藥物[33]、有機(jī)聚合物、抗腫瘤藥物[34-35]和油溶性天然物質(zhì)的分離領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

聚苯乙烯呈中性，交聯(lián)聚苯乙烯-二乙烯基苯微球具有多孔結(jié)構(gòu)，多被用于親脂性聚合物分子量的測(cè)量以及使用有機(jī)洗脫溶質(zhì)進(jìn)行分子量測(cè)量[36]。另外可用于分離結(jié)構(gòu)相似的分子。

超交聯(lián)聚苯乙烯的交聯(lián)度和機(jī)械強(qiáng)度極高，與其他填料相比具有更高的耐壓性以及耐化學(xué)性，作為填料使用時(shí)可承受色譜柱中的高壓降。它可以使用任何pH值的水性洗脫液，這對(duì)硅膠填料來(lái)說(shuō)是不可能實(shí)現(xiàn)的。因此，超交聯(lián)聚苯乙烯可用于反相、分配、尺寸排阻色譜等。雖然聚合物表面上沒(méi)有可測(cè)量的極性和帶電基團(tuán)，然而其能夠?qū)﹄x子混合物進(jìn)行有效分離。

孫磊麗等[37]以呈中性的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)微球?yàn)樘盍希畛溆赟-X3玻璃柱作為GPC凈化柱，建立了一種檢測(cè)甘草中16種農(nóng)殘的方法。沈習(xí)習(xí)等[38]選用苯乙烯樹(shù)脂為填料填充SX-3柱作為凈化柱，建立了一種檢測(cè)北京烤鴨鴨皮中16種多環(huán)芳烴的方法。Xu等[36]通過(guò)改性的種子聚合法合成聚苯乙烯多孔微球，發(fā)現(xiàn)合成的微球在碘萃取上具有良好性能。袁媛[39]以苯乙烯為單體，過(guò)硫酸鉀為引發(fā)劑，二乙烯基苯為交聯(lián)劑，采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)活性聚合的無(wú)皂乳液聚合法制備了單分散的聚苯乙烯交聯(lián)微球。顧玥等[40]采用懸浮聚合法和超交聯(lián)兩步法制備了一種介孔改性聚苯乙烯微球，此微球在血液凈化領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用。Cong等[41]通過(guò)改進(jìn)后的兩步種子溶脹法制備出粒徑約為10 μm的單分散交聯(lián)聚苯乙烯微球，發(fā)現(xiàn)改性后的微球?qū)τ袡C(jī)酸以及手性藥物有良好的分離效果。

聚苯乙烯微球(PST)具有理想的機(jī)械強(qiáng)度、可調(diào)節(jié)的粒徑和良好的化學(xué)穩(wěn)定性，被普遍用作固定化載體。但使用微球進(jìn)行固定的報(bào)道很少，Li等[42]制備了具有大孔和巨孔的PST,研究了孔徑對(duì)脂肪酶分布、相對(duì)活性、動(dòng)力學(xué)行為、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性的影響。根據(jù)激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)(如圖1)和掃描電鏡(SEM)，發(fā)現(xiàn)脂肪酶滲透到巨孔和大孔微球的中心，而介孔微球只在表面發(fā)生吸附現(xiàn)象。另外，固定化脂肪酶的比活性與巨孔/大孔/中孔PST的孔徑密切相關(guān)。在100次循環(huán)結(jié)束后仍具有很高的穩(wěn)定性，且微球固化酶表現(xiàn)出較高的活性。因此，與其他微球相比，大孔PST作為工業(yè)上潛在的酶載體顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 巨孔(A)、大孔(B)和中孔(C)PST微球固定化熒光胺脂肪酶的LSCM圖[42]Fig.1 LSCM images of fluorescamine-lipase immobilized on gigaporous(A),macroporous(B) and mesoporous(C) PST microspheres[42]scale bars represent 10 μm in each case; corresponding fluorescence distribution profiles along diameter are displayed below

4 瓊脂糖凝膠

瓊脂糖(Agarose)作為一種天然高分子材料，在生物相容性方面表現(xiàn)出色。瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖單體作為原料制備得到。瓊脂糖分為普通瓊脂糖和化學(xué)修飾的低熔點(diǎn)瓊脂糖。因瓊脂糖具備較大的孔徑，瓊脂糖凝膠常被用于大分子蛋白質(zhì)[43]和DNA等物質(zhì)的分離。瓊脂糖凝膠微球是呈多孔、親水和電中性的一種常用多糖微球，其多糖鏈具有幾個(gè)羥基可被活化并偶聯(lián)不同基團(tuán)[44]。瓊脂糖微球的傳統(tǒng)制備方法主要有噴射法[45]、懸浮攪拌法[46]、微流控制法[47]和膜乳化法[48]等。

纖維素基吸附劑因生產(chǎn)成本低、易改性和生物相容性而受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，纖維素的固有缺陷，如弱機(jī)械性能和高結(jié)晶度等會(huì)嚴(yán)重影響分離效率。為克服這些問(wèn)題，Zhao等[49]提出了一種預(yù)交聯(lián)結(jié)合瓊脂糖雜交的方法(如圖2)構(gòu)建高強(qiáng)度、低結(jié)晶度的纖維素基微球。纖維素/瓊脂糖復(fù)合微球具有優(yōu)異的機(jī)械穩(wěn)定性，在蛋白質(zhì)分離方面具有巨大潛力。為研究其在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用潛力，用2-二乙基胺鹽酸鹽對(duì)預(yù)交聯(lián)纖維素/瓊脂糖復(fù)合微球(PRCA)、后交聯(lián)纖維素/瓊脂糖復(fù)合微球(POCA)進(jìn)行了改性，并對(duì)其吸附容量、吸附速率和可回收性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖2 PRCA和POCA的制備[49]Fig.2 Preparation of PRCA and POCA[49]A：the crosslinking agent(epichlorohydrin) is preliminarily mixed with cellulose and agarose aqueous solution(pre-crosslinking),while the epichlorohydrin is added after emulsification in post-crosslinking process;B：the mechanism of cellulose and agarose chains crosslinked by ECH；C：the cellulose and agarose chains in PRCA are evenly crosslinked by covalent bonds while the internal cellulose and agarose chains of POCA is mainly crosslinked by hydrogen bonds

Zhao等[50]提出了一種改進(jìn)的膜乳化技術(shù)用于制備大粒徑瓊脂糖微球，其粒徑約為90 μm，且粒徑分布窄。通過(guò)增加水分散相中瓊脂糖的濃度，可制備均勻性在2%～10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)的微球。該研究中使用的膜乳化裝置放大后，可為制備工業(yè)應(yīng)用的均勻尺寸瓊脂糖色譜填料提供一種有效的新工具。

瓊脂糖凝膠微球在很多領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用，其中在分離分析領(lǐng)域應(yīng)用尤為突出。邱廣亮等[51]選用瓊脂糖等天然高分子材料在磁性氧化鐵粒子表面進(jìn)行包覆，制備得到磁性瓊脂糖微球。發(fā)現(xiàn)該磁性微球兼具兩種材料的優(yōu)點(diǎn)，磁性使其能夠進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向，此外還有良好的生物相容性、表面具備大量官能團(tuán)、良好的分散性，具有極為廣闊的發(fā)展利用用途。尹霜霜等[52]采用反向懸浮再生法制備磁性瓊脂糖微球，經(jīng)交聯(lián)活化后進(jìn)行溴代醇化及其配基的偶聯(lián)，用于分離牛血清蛋白，在合適pH值下最大吸附容量為79 mg/g，循環(huán)使用5次后吸附容量降至最大吸附容量的76%，證明多次使用后仍具有較好的吸附性能。劉微等[53]利用反相懸浮原理制備瓊脂糖凝膠微球并進(jìn)行交聯(lián)，以此為基質(zhì)經(jīng)過(guò)羧基化反應(yīng)制得羧甲基瓊脂糖微球，發(fā)現(xiàn)以此微球作為填料在國(guó)產(chǎn)堿性蛋白酶的分離純化、除色、除味等方面有著較好的效果，可達(dá)到國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品效果。劉姍等[54]建立了一種使用瓊脂糖微球抗體對(duì)原代乳鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行篩選的新方法。

5 其 他

與常用的固定相相比，氧化鋯在化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度方面的性能更為出色，因此吸引了很多研究者的關(guān)注[55]。氧化鋯的pH值穩(wěn)定性和對(duì)堿性物質(zhì)優(yōu)越的分離效果使其在生物化學(xué)、制藥產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于氨基酸和多肽等生物分子。在蛋白質(zhì)[56-57]、核酸、單克隆抗體分離[58-59]，對(duì)烷基取代的苯、芳烴、多環(huán)芳烴的分離也有報(bào)道[60]。氧化鋯還展示了各種極端條件下其在分離方面的獨(dú)特潛力[61-62]。若要實(shí)現(xiàn)高效率的分離，制備粒徑均勻且分布窄的氧化鋯微球最為關(guān)鍵。目前氧化鋯微球的制備方法比較單一，主要有聚合-誘導(dǎo)膠體凝聚法(PICA)和油乳化法(OEM)。相較于前者，后者操作更簡(jiǎn)單，但后者制得的氧化鋯微球單分散性差且孔徑更小。目前我國(guó)多采用第一種方法制備氧化鋯微球。在國(guó)外，有許多關(guān)于通過(guò)PICA法制備氧化鋯微球的報(bào)道和專(zhuān)利。但國(guó)內(nèi)關(guān)于制備條件對(duì)微球結(jié)構(gòu)、粒徑和粒徑分布影響的報(bào)道相對(duì)較少。

作為一種硅膠填料，無(wú)孔硅膠的粒徑小于2 μm(亞2 μm)，合成方法主要有Stber微球法[63-64]、Unger法[65-66]、Barder法[67]、水熱法[68]、速率法[69]等。作為一種新型色譜柱填料，無(wú)孔硅膠具有很多良好的性質(zhì)：其表面無(wú)孔且單分散性較好；具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。相較于無(wú)孔硅膠填料，多孔硅膠的孔徑分布在30 nm左右，且受傳遞介質(zhì)阻力的影響，多孔硅膠在有機(jī)分析中存在很大的局限性，有機(jī)物的最大分子質(zhì)量不能超100 kDa。研究發(fā)現(xiàn)，制備更小粒徑的無(wú)孔硅膠填料有利于縮短分析時(shí)間、提高柱效，克服大粒徑多孔硅膠在傳質(zhì)中存在的缺點(diǎn)，故近年來(lái)的研究熱點(diǎn)集中于小粒徑無(wú)孔硅膠上。

6 結(jié) 論

凝膠滲透色譜法作為色譜分離技術(shù)的一種，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、化學(xué)化工等學(xué)科研究和工業(yè)生產(chǎn)中。伴隨著這些領(lǐng)域的強(qiáng)勁需求與發(fā)展，新的挑戰(zhàn)不斷出現(xiàn)。作為色譜技術(shù)的核心，色譜柱填料不僅是建立色譜方法的基礎(chǔ)，也是消耗品。近年來(lái)，色譜填料呈現(xiàn)兩大趨勢(shì)：一是亞2 μm小孔硅膠、核殼型硅膠填料；二是具有豐富選擇性的色譜填料，如手性色譜填料、親水作用色譜填料和混合模式色譜填料等。與上述常見(jiàn)填料相比，有機(jī)高分子基質(zhì)色譜填料領(lǐng)域近年來(lái)也十分活躍，其主要可分為多糖型基質(zhì)填料和聚合物型基質(zhì)填料。與傳統(tǒng)填料相比，此填料具有更高的負(fù)載量和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，使其在生物大分子的分離分析領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛，但現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)對(duì)此類(lèi)填料的研究相對(duì)落后，還有很長(zhǎng)的路需要探索。