煙草黑脛病不同菌株對不同藥劑的抗性評價

楊應(yīng)美,盧燦華,蓋曉彤,姜 寧,陳齊斌,蘇家恩,吳德喜*,夏振遠(yuǎn)*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,云南 玉溪 653100;3.云南省煙草公司 大理州公司,云南 文山 671000)

煙草黑脛病(Tobacco black shank)是由煙草疫霉菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)引起的根莖類病害[1],在我國各大煙區(qū)都有發(fā)生,每年造成的損失達(dá)數(shù)億元[2],是制約我國煙草優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)的重要因素[3]。因此,必須重視對煙草黑脛病的防控。煙草黑脛病的防治措施包括農(nóng)業(yè)防治、種植抗病品種[4]、化學(xué)防治[5]和生物防治[6]等,其中化學(xué)防治是最有效的方法[7]。而化學(xué)殺菌劑是防治煙草黑脛病的主要藥劑,目前登記在冊可以防治疫霉類的殺菌劑主要有苯胺類、羧酸酰胺類、丙烯酸酯類、烷基鹽酸鹽類、惡唑類、氨基酸類等,常用藥劑為嘧菌酯、烯酰嗎啉、氟啶胺以及甲霜靈等[8-9]。但化學(xué)藥劑的濫用及對病原菌的高度選擇性,致使高抗藥性病原菌不斷產(chǎn)生,從而使這些常規(guī)藥劑對煙草黑脛病的防治效果下降,不能滿足生產(chǎn)需求[6]。例如,Yang T等[10]發(fā)現(xiàn)已有煙草黑脛病菌株對甲霜靈產(chǎn)生抗藥性。王革等[12]曾在1997年對煙草疫霉對甲霜靈的敏感性進(jìn)行了研究,在云南煙區(qū)未發(fā)現(xiàn)對甲霜靈產(chǎn)生抗性的菌株。但甲霜靈在煙草上應(yīng)用已超過30年,煙草疫霉抗性菌株已在美國、西班牙和南非陸續(xù)出現(xiàn)[13-14],我國也有煙草疫霉菌對甲霜靈產(chǎn)生抗藥性的報道[15]。同時有研究[16]表明,瀘州煙區(qū)已經(jīng)有中抗甲霜靈和烯酰嗎啉的菌株的出現(xiàn),說明這兩種藥劑均存在一定的抗性風(fēng)險。在法國已經(jīng)檢測到葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉產(chǎn)生抗性的菌株,證實(shí)了烯酰嗎啉存在抗性風(fēng)險[10]。上述前人的研究結(jié)果表明在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上無形中加大了化學(xué)藥劑的使用量,而煙草作為葉用作物,對煙草過量施用農(nóng)藥不僅會影響其品質(zhì),還會嚴(yán)重危害人體的健康,影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。因此,迫切需要開發(fā)有效、安全和環(huán)保的殺菌劑替代當(dāng)前常規(guī)藥劑。

烯酰嗎啉、氟嗎·乙鋁、霜霉威、噁霉·稻瘟靈這4種藥劑是目前登記防治煙草黑脛病的農(nóng)藥產(chǎn)品,而福美異菌脲、菌核凈·錳鋅、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、甲基硫菌靈、多菌靈這7種藥劑用于防治煙草黑脛病的應(yīng)用還沒有取得正式登記[17]。本研究采用菌絲生長速率法測定了2019年從云南不同地區(qū)采集的煙草黑脛病菌菌株對上述11種藥劑的抗藥性,以期為云南煙草疫霉菌的防治和抗性治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2019年從云南省主要煙區(qū)采集具有典型癥狀的27份煙草黑脛病病株,在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定，得到煙草疫霉菌27株用于實(shí)驗(yàn)。其中,來自紅河(HH)的菌株有5株,來自昆明(KM)的菌株有3株,來自臨滄(LC)的菌株有8株,來自曲靖(QJ)的菌株有4株,來自文山(WS)的菌株有7株。

1.2 供試藥劑及藥劑工作濃度

供試藥劑有11種,參照產(chǎn)品推進(jìn)使用濃度制定測試工作濃度如下:50%烯酰嗎啉可濕性粉劑(T1)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L;50%福美異菌脲可濕性粉劑(T2)0、0.13、0.25、0.5、1、2、4 mg/L;50%氟嗎·乙鋁可濕性粉劑(T3)0、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;55%菌核凈·錳鋅可濕性粉劑(T4)0、0.63、1.25、2.5、5 、10、15 mg/L;4%春雷霉素可濕性粉劑(T5)0、0.5、1.0、2.0、4.0、5、8 mg/L;12.5%腈菌唑可濕性乳劑(T6)0、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;15%三唑酮可濕性粉劑(T7)0、0.5、1、2、4、8 mg/L;20%噁霉·稻瘟靈液劑(T8)0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0 mg/L;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(T9)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;50%多菌靈可濕性粉劑(T10)0、0.02、0.03、0.06、0.13、0.25、1 mg/L;72.2%霜霉威水劑(T11)0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L。

1.3 煙草疫霉菌對11種藥劑的抗性測定

先將供試藥劑用丙酮或無菌水配成有效濃度為1%或10%(w/v)的母液,置于4 ℃冰箱中備用。在測定時,根據(jù)含藥濃度與培養(yǎng)基的用量,用移液器吸取一定量的藥劑母液稀釋液加入熔化并冷卻至60 ℃的培養(yǎng)基中,充分搖勻后制板,每皿25 mL。在燕麥瓊脂平板上培養(yǎng)(26 ℃,黑暗)3～4 d的參試菌株菌落邊緣打出直徑7 mm菌餅,將菌餅接種到不同濃度梯度含藥平板中央,菌絲面朝下,每平板接種1塊,每種濃度1個處理,每個處理3次重復(fù),放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d。用十字交叉法測量各供試藥劑不同濃度處理的菌落生長直徑(mm),取平均值后計算抑制率，計算公式為:抑制率(%) =(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100。

根據(jù)生物統(tǒng)計機(jī)率換算表[18],將抑制百分率轉(zhuǎn)換成抑制機(jī)率值,并將濃度值轉(zhuǎn)換成對數(shù)值,以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),以抑制機(jī)率為縱坐標(biāo),繪制殺菌劑的回歸曲線,并求出不同殺菌劑對病菌的毒力回歸直線方程、抑制中濃度EC50及相關(guān)系數(shù)(r)[19，20]。

1.4 煙草疫霉菌對藥劑的抗性水平分析

參考蘭波等[21]對抗性指數(shù)的計算方法計算抗性指數(shù),劃分出敏感性菌株和抗性菌株,并對抗性菌株頻率進(jìn)行計算,確定抗性水平和抗性菌株頻率?？剐灾笖?shù)的計算公式為:抗性指數(shù)=參試菌株的EC50/敏感基線EC50。菌株抗性水平的劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：敏感菌株，抗性指數(shù)≤1;低抗菌株，1<抗性指數(shù)≤3;中抗菌株，3<抗性指數(shù)≤10;高抗菌株，抗性水平>10?？剐跃觐l率的計算公式如下:抗性菌株頻率(%)=(抗性菌株/供試菌株)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草疫霉菌對11種藥劑的抗性測定結(jié)果

依據(jù)測定的菌絲生長數(shù)據(jù)并按照1.3節(jié)的方法計算得到表1,數(shù)據(jù)顯示:11種藥劑對27株不同菌株均有一定的抑制作用,由強(qiáng)到弱依次為:50%烯酰嗎啉、50%福美異菌脲、50%氟嗎·乙鋁、55%菌核凈·錳鋅、4%春雷霉素、12.5%腈菌唑、15%三唑酮、20%噁霉·稻瘟靈、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈、72.2%霜霉威。說明這11種藥劑均可作為防治煙草黑脛病的初選藥劑,其中烯酰嗎啉對煙草疫霉菌的抑制效果最好,福美異菌脲次之,而霜霉威的抑制效果最差。

表1 煙草疫霉菌對11種藥劑的抗性測定結(jié)果

2.2 煙草疫霉菌對11種藥劑的抗性水平分析

根據(jù)生物測定數(shù)據(jù)并按照1.4節(jié)的方法計算抗性頻率和抗性水平，結(jié)果(表2)表明:對烯酰嗎啉敏感的菌株有16株,占59.26%；低抗菌株10株,占37.37%；中抗菌株1株,占3.70%；無高抗菌株；抗性菌株11株,抗性頻率為40.74%。對福美異菌脲低抗的菌株有11株,占40.74%；中抗菌株16株,占59.26%；無敏感和高抗菌株；抗性菌株27株,抗性頻率為100%。對其余9種藥劑來說，均為高抗菌株,抗性頻率均為100%。說明云南煙草疫霉菌已對氟嗎·乙鋁、菌核凈·錳鋅、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、噁霉·稻瘟靈、甲基硫菌靈、多菌靈和霜霉威產(chǎn)生了高度抗性,對福美異菌脲產(chǎn)生了中度抗性。

2.3 抗藥性水平在地區(qū)之間的差異分析

分析云南各地的抗藥性情況,結(jié)果(表2)顯示：5個不同煙區(qū)菌株對烯酰嗎啉的抗性頻率由大到小依次為:文山(57.14%)、紅河(40.00%)、臨滄(37.50%)、昆明(33.33%)和曲靖(25.00%),除了文山有1株中抗菌株外,其余地區(qū)的菌株均為敏感和低抗菌株;5個不同煙區(qū)菌株對福美異菌脲的抗性頻率均為100%,但沒有出現(xiàn)高抗菌株,均為低抗和中抗菌株;5個不同煙區(qū)菌株對其余9種藥劑的抗性頻率均為100%,且均為高抗菌株。說明在云南文山、紅河、臨滄、昆明和曲靖5個地區(qū)施用氟嗎·乙鋁、菌核凈·錳鋅、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、噁霉·稻瘟靈、甲基硫菌靈、多菌靈和霜霉威防控?zé)煵菀呙咕男Ч患?施用福美異菌脲的效果也不理想,施用烯酰嗎啉可能有一定的效果,但文山地區(qū)的煙草疫霉菌對烯酰嗎啉的抗性頻率比其它4個地區(qū)均要高一些。

表2 煙草疫霉菌對11種藥劑的抗性分析結(jié)果

2.4 煙草疫霉菌對11種殺菌劑抗藥性的表現(xiàn)型

根據(jù)供試的27個煙草黑脛病菌菌株對11種藥劑的抗、感性程度,可以分為2種表現(xiàn)型：T1RT2RT3RT4RT5RT6RT7RT8RT9RT10RT11R(對11種藥劑均表現(xiàn)抗性)、T1ST2RT3RT4RT5RT6RT7RT8RT9RT10RT11R(對烯酰嗎啉表現(xiàn)敏感,對其余10種藥劑表現(xiàn)抗性),其中第一種表現(xiàn)型有11株,所占比例為40.7%,第二種表現(xiàn)型有16株,所占比例為59.3%。在2種抗藥性表現(xiàn)類型中,對福美異菌脲、氟嗎·乙鋁、菌核凈·錳鋅、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、噁霉·稻瘟靈、甲基硫菌靈、多菌靈和霜霉威這10種藥劑均表現(xiàn)為抗性,說明不同地區(qū)在防治煙草黑脛病時,連續(xù)施用這10種藥劑會產(chǎn)生抗藥性,因此,不宜連續(xù)施用這10種藥劑防控云南煙草疫霉菌。烯酰嗎啉對煙草疫霉菌的防控效果較好,可以與生產(chǎn)上其他藥劑或生防菌混用或輪用。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：對烯酰嗎啉而言，云南省煙草疫霉菌以敏感菌株較多(占59.26%),為優(yōu)勢群體,而低抗菌株較少(37.37%),中抗菌株最少(3.70%),未出現(xiàn)高度抗性的菌群,抗性菌株11株,抗性頻率為40.74%;對福美異菌脲來說，云南省煙草疫霉菌以中抗菌株較多(59.26%),低抗菌株次之(40.74%),無高抗菌株,抗性菌株27株,抗性頻率為100%;對其余9種藥劑而言，云南省煙草疫霉菌均為高抗菌株,抗性頻率均為100%。說明云南省煙草疫霉菌對烯酰嗎啉沒有產(chǎn)生明顯的抗性,烯酰嗎啉對云南的煙草疫霉菌仍有很好的抑制作用,仍是防治煙草黑脛病的理想藥劑;對福美異菌脲產(chǎn)生了中度抗性,福美異菌脲用于防治云南煙草黑脛病效果不理想;對其余9種藥劑產(chǎn)生了高度抗性,這9種藥劑在防治云南煙草黑脛病中已經(jīng)沒有使用價值。

值得注意的是:(1)文山地區(qū)煙草疫霉菌對烯酰嗎啉的抗性頻率略高于其它4個地區(qū)的,而5個不同煙區(qū)菌株對其余10種藥劑的抗性頻率均相同(100%)。這可能與文山地區(qū)的用藥歷史和用藥水平有關(guān),可能文山地區(qū)煙農(nóng)存在用藥不規(guī)范的情況,如:單一使用藥劑,隨意增加用藥量,濫用或亂用藥劑等。(2)國內(nèi)其它省份以及國外曾報道過煙草疫霉菌對烯酰嗎啉產(chǎn)生了抗藥性，例如：戰(zhàn)徊旭等[11]報道瀘州煙區(qū)已經(jīng)有烯酰嗎啉的中抗菌株的出現(xiàn),說明施用烯酰嗎啉存在一定的抗性風(fēng)險；在法國已經(jīng)檢測到葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉的抗性菌株,證實(shí)了烯酰嗎啉存在抗性風(fēng)險[10]。因此,今后在防控云南文山以及其他同類煙區(qū)的煙草黑脛病時應(yīng)堅持烯酰嗎啉與其它藥劑或生防菌科學(xué)混用或輪用,或使用新藥劑,以延緩病菌產(chǎn)生抗藥性,有效提高防病效果。