外源赤霉素調(diào)控稻草飼用品質(zhì)后水稻轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜分析

董臣飛 許能祥 張文潔 顧洪如

摘要：為探索外源赤霉素（GA）調(diào)控稻草飼用品質(zhì)的分子機(jī)制，采用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)的水稻表達(dá)譜芯片技術(shù)，分析研究生育后期外源赤霉素處理后水稻轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜的變化。GA處理后雜交秈稻兩優(yōu)培九與其對(duì)照有28個(gè)基因表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中表達(dá)上調(diào)的有9個(gè)，下調(diào)的有19個(gè);表達(dá)差異明顯的基因主要屬于亞油酸代謝、α-亞麻酸的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝等途徑的基因。GA處理后粳稻品種南粳44有11個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生明顯差異，其中9個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)下調(diào);差異表達(dá)基因主要集中在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、晝夜節(jié)律等途徑上。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），驗(yàn)證4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因在GA處理后表達(dá)變化，與表達(dá)譜結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：水稻;赤霉素;轉(zhuǎn)錄因子;基因表達(dá)譜

中圖分類號(hào)：S511.01 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0141-05

稻草飼料化利用是當(dāng)前秸稈綜合利用研究的熱點(diǎn)。前人對(duì)稻草飼用的研究多集中在調(diào)制方法上[1-2]，但效果受到稻草理化性狀及機(jī)械設(shè)備等因素的限制。通過栽培及遺傳育種措施改善稻草飼用品質(zhì)是提高稻草飼用率的簡(jiǎn)易方法，但目前這方面的研究較少。在改善稻草飼用品質(zhì)的農(nóng)藝措施中，施用外源赤霉素（gibberellic acid，GA）是一種有效方式。前期研究表明，水稻（Oryza sativa）生育后期進(jìn)行外源GA處理能增加收獲時(shí)稻草的綠葉面積，提高稻草中的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（non-structural carbohydrates，NSC）和粗蛋白（crude protein，CP）含量，有效改善稻草飼用品質(zhì)[3-4]，但缺乏深入的機(jī)理研究。

筆者前期研究表明，外施GA后秈稻品種兩優(yōu)培九和粳稻品種南粳44稻草的飼用品質(zhì)得到顯著改善，其衰老進(jìn)程放緩;但是秈稻和粳稻品種間存在顯著差異：兩優(yōu)培九GA處理組稻草中的NSC和CP含量增加幅度顯著高于南粳44，與之相對(duì)應(yīng)的是葉片中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量顯著低于對(duì)照組，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性顯著高于對(duì)照，且其酶活性增加幅度高于南粳44，葉片中的GA含量和GA/脫落酸（ABA）的值均顯著高于對(duì)照組，且高于南粳44。這說明水稻生育后期噴施外源GA能顯著改善稻草飼用品質(zhì)，主要通過減少M(fèi)DA的積累量，提高SOD和POD活性，提高內(nèi)源GA含量及GA/ABA的值來實(shí)現(xiàn)，且對(duì)衰老進(jìn)程較快的秈稻品種兩優(yōu)培九的效果優(yōu)于粳稻品種南粳44[5]。但GA是如何改變水稻基因表達(dá)，對(duì)生理性狀產(chǎn)生影響的分子機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

本研究在前期外源GA對(duì)稻草飼用品質(zhì)及水稻內(nèi)源激素含量和衰老相關(guān)生理指標(biāo)影響的基礎(chǔ)上，采用兩優(yōu)培九和南粳44這2個(gè)不同類型水稻品種為試驗(yàn)對(duì)象，于開花后15 d噴施45 g/hm2 GA，在處理后采集水稻葉片樣品，分析外源GA處理對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜的影響，以期為揭示外源赤霉素調(diào)控稻草飼用品質(zhì)的分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用江蘇地區(qū)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的2個(gè)不同類型優(yōu)質(zhì)水稻品種（雜交秈稻兩優(yōu)培九、早熟晚粳南粳44）進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與田間管理

試驗(yàn)于2015年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻試驗(yàn)田進(jìn)行。于2015年5月10日播種，6月13日插秧。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每小區(qū)10行，每行10株，1穴1株，行株距為30 cm×20 cm。按照常規(guī)水稻進(jìn)行肥水管理。

1.3 測(cè)定內(nèi)容及方法

水稻開花后挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的主莖倒1葉掛牌，在水稻開花后15 d（9月8日）上午噴藥，GA噴施濃度為45 g/hm2。噴藥后14 d（9月22日，即開花后29 d）取樣。采集主莖倒1葉，用錫箔紙包好放入液氮罐中冷凍保存。樣品質(zhì)檢合格后，構(gòu)建表達(dá)譜測(cè)序文庫(kù)，基于Illumina技術(shù)測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行雙端測(cè)序（測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq2500;測(cè)序方式為PE100）。采用與表達(dá)譜測(cè)序相同的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析驗(yàn)證芯片的試驗(yàn)結(jié)果?；虮磉_(dá)譜分析及實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證均委托廣州銳博生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素處理后雜交秈稻顯著差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄譜

圖1是兩優(yōu)培九CK的3個(gè)重復(fù)樣本以及GA處理3個(gè)重復(fù)樣本中都表達(dá)差異的基因匯總，其中紅色區(qū)域表示表達(dá)上調(diào)基因，綠色區(qū)域表示表達(dá)下調(diào)基因，黑色表示表達(dá)不變。兩優(yōu)培九開花后 15 d 噴施GA處理后，對(duì)照組和GA處理組有28個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中表達(dá)上調(diào)的有9個(gè)，下調(diào)的有19個(gè)。

如圖2所示，表達(dá)差異顯著的基因主要屬于亞油酸代謝、α-亞麻酸的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝等途徑。

2.2 赤霉素處理后粳稻品種南粳44顯著差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄譜

由圖3可知，粳稻品種南粳44 GA處理后有11個(gè)基因的表達(dá)差異顯著，其中9個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。如圖4所示，表達(dá)差異顯著的基因主要屬于類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、晝夜節(jié)律-植物等途徑。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

在表達(dá)差異顯著的基因中選取植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因Os03t0402800[第3號(hào)染色體（chr03）：16407695～16410007]和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）及淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100[第2號(hào)染色體（chr02）：343057～346875]進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證;括號(hào)中數(shù)字表示染色體上的位置。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證所用材料與用于表達(dá)譜測(cè)序的材料及處理方式完全一樣。對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，兩優(yōu)培九中Os03t0402800基因表達(dá)量在GA處理后明顯升高，而南粳44中該基因表達(dá)量在GA處理后反而下降;兩優(yōu)培九和南粳44中Os03t0181100在GA處理后基因表達(dá)量均下降，但差異不明顯;兩優(yōu)培九和南粳44中的Os03t0757900在GA處理后均明顯升高;兩優(yōu)培九中Os02t0106100在GA處理后小幅下降，而南粳44中卻明顯升高，這些結(jié)果與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果基本一致（圖5）。

兩優(yōu)培九對(duì)照和GA處理共同表達(dá)差異的12個(gè)基因是Os04t0650750、Os01t0186950、Os01t0186900、Os01t0556650、Os01t0850550、Os04t0650700、Os05t0312600、Os02t0808601、Os03t0757900、Os05t0161500、Os10t0509401、Os05t0380900;南粳44對(duì)照和GA處理共同差異表達(dá)的4個(gè)基因分別是Os08t0386200、Os04t0423400、Os01t0838350和Os09t0522000;兩優(yōu)培九和南粳44對(duì)照和GA處理組共同差異表達(dá)基因只有1個(gè)，是位于第6號(hào)染色體（chr06）的2162738～2165150區(qū)間的Os06t0141200。

3 討論

前期研究表明，外源GA改善稻草飼用品質(zhì)的生理機(jī)制主要通過有效減少葉片中MDA的積累，提高水稻葉片的SOD和POD活性來實(shí)現(xiàn)[5]。在苜蓿上使用GA有類似效果[6]，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量是脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)之一。它可引起生物大分子的變性或降解及生物合成的降低，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[7]。研究表明，GA能有效抑制水稻旗葉MDA含量的上升，降低旗葉的脂質(zhì)過氧化速度，減少M(fèi)DA對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，對(duì)延緩細(xì)胞衰亡有一定作用[8]。

本研究結(jié)果表明，外源GA處理后，秈稻和粳稻品種基因表達(dá)譜的變化存在一定差異。水稻基因組中編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因數(shù)有1 306個(gè)。這些轉(zhuǎn)錄因子功能復(fù)雜，參與了包括植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、生物和非生物脅迫以及植物激素的代謝和傳導(dǎo)等各個(gè)方面的調(diào)控作用。本研究中兩優(yōu)培九和南粳44對(duì)照轉(zhuǎn)錄差異的基因包含有與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因Os03t0402800（chr03：16407695～16410007）和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）（圖1至圖4）。而筆者前期研究表明，外源GA處理對(duì)兩優(yōu)培九和南粳44的作用效果不同，GA處理對(duì)衰老進(jìn)程慢的粳稻品種南粳44延緩衰老、改善稻草飼用品質(zhì)的效果不如對(duì)衰老進(jìn)程較快的秈稻品種兩優(yōu)培九影響效果顯著[5]。這意味著兩優(yōu)培九和南粳44本身存在激素代謝差異，而筆者前期結(jié)果驗(yàn)證了這一推論：外源GA處理后，水稻葉片中的內(nèi)源激素含量發(fā)生了顯著變化，秈稻和粳稻品種間存在顯著差異，兩優(yōu)培九對(duì)照的GA含量和GA/ABA的值在2次取樣時(shí)均顯著低于南粳44對(duì)照，ABA含量高于南粳44，兩優(yōu)培九GA處理的GA含量和GA/ABA的值在2次取樣時(shí)均極顯著高于對(duì)照（P<0.01），變化幅度高于南粳44[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)，GA調(diào)控后淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100（chr02：343057～346875）發(fā)生變化（圖1至圖2），而前期研究表明在水稻生育后期進(jìn)行外源GA處理能有效提高稻草中的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（NSC）含量[4]，這意味著Os03t0757900和Os02t0106100基因可能參與了稻草中NSC代謝積累的過程。

本研究中GA處理后植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因Os03t0402800（chr03：16407695～16410007）和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）及淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100（chr02：343057～346875）的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)發(fā)生顯著變化，但其參與的GA處理后基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚，而這對(duì)深入了解轉(zhuǎn)錄因子的功能及其在調(diào)控中扮演的角色至關(guān)重要。今后筆者將進(jìn)一步用RNA干擾、蛋白互作等技術(shù)進(jìn)一步研究水稻響應(yīng)GA處理過程的分子機(jī)制及相互間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將轉(zhuǎn)錄因子基因應(yīng)用于稻草飼用品質(zhì)的改善中，以期綜合提高稻草飼用品質(zhì)。

4 結(jié)論

外源赤霉素能有效調(diào)控稻草飼用品質(zhì)。兩優(yōu)培九經(jīng)GA處理后，其對(duì)照和GA處理有28個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中表達(dá)上調(diào)的有9個(gè)，下調(diào)的有19個(gè)。表達(dá)差異顯著的基因主要屬于亞油酸代謝、α-亞麻酸的代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝等途徑。粳稻品種南粳44經(jīng)GA處理后有11個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著差異，其中9個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)基因主要集中在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、植物晝夜節(jié)律等途徑上。

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