努爾凱麥爾·木拉提 楊亞杰 帕爾哈提·阿布都克日木 瑪依努爾·吾斯曼
摘要:測(cè)定植物葉綠素含量有多種方法,以小麥為材料,在前人研究的基礎(chǔ)上,驗(yàn)證長(zhǎng)勢(shì)相近的小麥葉片在同等試驗(yàn)條件之下,比較測(cè)定葉綠素含量的6種方法。結(jié)果表明,原子吸收光譜法所測(cè)得的葉綠素含量最高且結(jié)果最準(zhǔn)確、可靠;浸提法所得的葉綠素含量也較高但時(shí)間過(guò)長(zhǎng);研磨法結(jié)果偏低且過(guò)程繁瑣;葉綠素儀法并不適合作為精確測(cè)量葉綠素含量的方法。所測(cè)葉綠素含量從高到低依次為原子吸收光譜法>無(wú)水乙醇浸提法>80%乙醇浸泡法>95%乙醇研磨-過(guò)濾法>95%乙醇研磨-離心法>葉綠素儀法。此結(jié)論可為其他研究者提供一定的參考價(jià)值。
關(guān)鍵詞:小麥;葉綠素;原子吸收光譜法;浸泡法;研磨法
中圖分類(lèi)號(hào): S512.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號(hào):1002-1302(2021)09-0156-04
小麥(Triticum aestivum L.)是一種糧食作物,其產(chǎn)量的提高可以極大地推動(dòng)農(nóng)業(yè)發(fā)展。而影響小麥產(chǎn)量最重要的因素是其中的葉綠素含量,葉綠素含量常作為評(píng)定植物適應(yīng)環(huán)境能力和生長(zhǎng)狀況的一個(gè)重要項(xiàng)目[1]。因此小麥葉綠素含量測(cè)定的研究就顯得格外重要,其測(cè)定方法有很多,但是對(duì)各種方法的比較卻鮮見(jiàn)報(bào)道。針對(duì)這一現(xiàn)象,筆者所在課題組把各種方法進(jìn)行比較找出各自?xún)?yōu)缺點(diǎn),并在筆者所在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)方法的葉綠素含量測(cè)定。以期為他人選擇最適合的方法測(cè)定葉綠素含量提供參考,為合理試驗(yàn)、科研奠定一定的基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 小麥種子的處理
取預(yù)先準(zhǔn)備好的小麥種子,從中選取顆粒飽滿的種子,自來(lái)水沖洗表面灰塵和雜質(zhì)后備用;用自來(lái)水將120 mm培養(yǎng)皿沖洗干凈,晾干,放上2~3張濾紙,用水打濕。將備用的小麥種子平鋪在濾紙上,放入4~5個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng),放到陽(yáng)光充足、溫度適宜的地方進(jìn)行培養(yǎng),隔3~4 h澆1次水。觀察小麥生長(zhǎng)情況,待小麥苗長(zhǎng)至5 cm時(shí)移到花盆中進(jìn)行后續(xù)生長(zhǎng),待小麥葉片蔥綠,高度約10 cm時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行試驗(yàn)。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 95%乙醇研磨-過(guò)濾法 取新鮮干凈小麥葉片,稱(chēng)量0.4 g于研缽中剪碎,加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4~6 mL 95%乙醇,研磨成勻漿,繼續(xù)加入95%乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨?,靜置一段時(shí)間,取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁,用乙醇潤(rùn)濕,玻璃棒置于濾紙3層處,把勻漿沿玻璃棒引流,過(guò)濾到 50 mL 棕色容量瓶中,用乙醇洗研缽及玻璃棒,一并轉(zhuǎn)入,最后用95%乙醇定容至50 mL,重復(fù)2次。
取潔凈比色皿(用手拿住比色皿的糙面),先用少量待測(cè)液清洗2~3次,然后將溶液倒入比色皿中(高度不得超過(guò)比色皿總高的4/5),將灑出的溶液用濾紙吸掉,第1個(gè)比色皿中放95%乙醇溶液為空白對(duì)照。然后測(cè)定其在波長(zhǎng)663 nm和645 nm處的吸光度。每個(gè)重復(fù)在不同波長(zhǎng)下測(cè)3次,取平均值。
1.2.2 95%乙醇研磨-離心法 取新鮮干凈小麥葉片,稱(chēng)取0.5 g于研缽中剪碎,加入少許石英砂和碳酸鈣粉及3 mL 95%乙醇,研磨成勻漿,再加95%乙醇3~5 mL,靜置一段時(shí)間,將勻漿轉(zhuǎn)入10 mL離心管中,并用適量95%乙醇洗滌研缽,一并轉(zhuǎn)入,然后以4 000 r/min離心10 min后,棄沉淀,上清液用95%乙醇定容至10 mL,重復(fù)2次。
取上述色素提取液2 mL,加95%乙醇16 mL稀釋得到待測(cè)液;測(cè)定與計(jì)算方法同“1.2.1”節(jié)。
1.2.3 無(wú)水乙醇浸提法 稱(chēng)取新鮮干凈小麥葉片0.02 g,將其剪成長(zhǎng)度約5 mm、寬度約1 mm的細(xì)絲。將準(zhǔn)備好的細(xì)絲等量分別放入3支試管中(試管用黑塑料袋包裹),滴加10 mL無(wú)水乙醇,室溫下暗處浸泡提取3 d左右,期間加以搖晃可縮短浸泡時(shí)間,至小麥葉片無(wú)色或白色。
將提取液再次定容至10 mL;測(cè)定與計(jì)算方法同“1.2.1”節(jié),其中空白對(duì)照為無(wú)水乙醇。
1.2.4 80%乙醇浸提法 步驟同“1.2.3”節(jié),只需用80%乙醇溶液替代無(wú)水乙醇即可。
1.2.5 葉綠素儀法 手持CM-1000葉綠素測(cè)量?jī)x,距離小麥葉片30.5~183.0 cm,打開(kāi)開(kāi)關(guān),即可進(jìn)行掃描,等數(shù)據(jù)出現(xiàn)后進(jìn)行記錄,間隔2 s就可以進(jìn)行下一次測(cè)量,重復(fù)3次取平均值。
1.2.6 原子吸收光譜法 鎂標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:將配制好的1.000 mg/mL鎂儲(chǔ)備液稀釋至 10.00 μg/mL,得到鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液。移此溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 mL于6個(gè)50 mL的容量瓶中,再分別滴加20 mL 0.8 mol/mL HCl溶液,用蒸餾水定容。得濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液,以濃度為0的溶液作為空白對(duì)照,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液在285 nm處的吸光度,分別為0.015、0.116、0.245、0.418、0.552、0.743,繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性函數(shù)為y=0.726 5x+0.033 3,見(jiàn)圖1。
取新鮮干凈小麥葉片,稱(chēng)取約2.0 g剪碎,加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4~6 mL無(wú)水乙醇,研磨成勻漿,繼續(xù)加入無(wú)水乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨?,靜置一段時(shí)間,取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁,用乙醇潤(rùn)濕,玻璃棒置于濾紙3層處,把勻漿沿玻璃棒引流,過(guò)濾到50 mL棕色容量瓶中,用乙醇洗研缽及玻璃棒,一并轉(zhuǎn)入,最后用無(wú)水乙醇定容至50 mL,重復(fù)2次。得到小麥葉綠素提取液,置于避光處備用。
取上述葉綠素提取液4.0 mL于分液漏斗中,滴加4.0 mL石油醚,輕輕搖動(dòng);再加4.0 mL NaCl溶液,上下振蕩;再加入12.0 mL蒸餾水,充分振蕩以后靜置分層,深綠色的石油醚層在上層,水-乙醇層在下層。從下面倒出水-乙醇層,再用4.0 mL石油醚重復(fù)萃取2次,然后合并3次所得到的石油醚相。于其中加入20 mL 0.8 mol/L的HCl溶液,充分振蕩后放置分層,將水相轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,得到待測(cè)液。
2 結(jié)果與分析
由表1可見(jiàn),95%乙醇研磨-過(guò)濾法所測(cè)得的葉綠素含量高于95%乙醇研磨-離心法;無(wú)水乙醇浸提法所測(cè)得的葉綠素含量高于80%乙醇浸提法;浸提法所測(cè)得的葉綠素含量均高于研磨法;葉綠素儀法無(wú)法測(cè)出葉綠素a、葉綠素b含量。原子吸收光譜法測(cè)得的葉綠素總量為(4.025±0.110) mg/g,其所測(cè)得的葉綠素總量最高,且標(biāo)準(zhǔn)差也最小,所以此方法所測(cè)結(jié)果最準(zhǔn)確,但缺點(diǎn)是無(wú)法測(cè)出葉綠素a、葉綠素b的含量。
小麥葉片在經(jīng)過(guò)95%乙醇溶液研磨之后,過(guò)濾法與離心法測(cè)得的葉綠素含量有明顯差異。過(guò)濾法所測(cè)得的含量高于離心法,說(shuō)明在離心的過(guò)程中,勻漿從研缽轉(zhuǎn)移到離心管以及葉綠素提取液從離心管轉(zhuǎn)移到試管的過(guò)程中,小麥葉綠素遭到光、氧的損傷,同時(shí)還存在溶液灑出的情況,導(dǎo)致離心法測(cè)得的含量偏低;而在過(guò)濾的過(guò)程中,并沒(méi)有頻繁的轉(zhuǎn)移過(guò)程,直接過(guò)濾定容到容量瓶即可,可避免葉綠素的損失。
乙醇作為提取劑來(lái)浸泡小麥葉片,不同濃度乙醇處理測(cè)得的葉綠素含量不同,可知提取劑濃度會(huì)影響葉綠素含量的測(cè)定。在相同條件之下,采用無(wú)水乙醇浸泡比80%乙醇浸泡測(cè)定效果更好,說(shuō)明乙醇濃度越低其含水量越高,葉綠素在其提取劑中的溶解度降低,所以測(cè)得的葉綠素含量降低。
浸提法測(cè)得的數(shù)據(jù)均比研磨法高,說(shuō)明浸提法對(duì)小麥葉片的損害較少。在研磨過(guò)程中,研磨時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使葉綠素受到光解,且過(guò)程比較繁瑣,既要進(jìn)行研磨,還有后續(xù)的過(guò)濾或離心處理,葉綠素含量會(huì)發(fā)生一定的減少。而浸提法只需將小麥葉片剪成細(xì)絲狀就可以直接放入浸提液中反復(fù)浸泡,至葉絲變白或無(wú)色即可,過(guò)程較簡(jiǎn)單,且所測(cè)含量也較高。
葉綠素儀法測(cè)得的結(jié)果是最低的,因?yàn)樵跍y(cè)量過(guò)程中,CM-1000葉綠素儀所要求的待測(cè)植物的面積直徑最低應(yīng)為1.35 cm,而試驗(yàn)中所采用的小麥葉片由于生長(zhǎng)時(shí)間較短,寬度僅為0.2~0.4 cm;又因?yàn)槭褂萌~綠素儀測(cè)定時(shí),小麥葉片呈現(xiàn)一定程度的發(fā)黃現(xiàn)象,導(dǎo)致最終結(jié)果偏低。說(shuō)明此方法無(wú)法測(cè)出準(zhǔn)確數(shù)據(jù),但是它的整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程極其簡(jiǎn)單,對(duì)待測(cè)樣品也沒(méi)有嚴(yán)格的處理要求,只需保持一定的距離進(jìn)行掃描即可得出葉綠素含量。
原子吸收光譜法所測(cè)得的葉綠素總量為 4.025 mg/g,為6種方法中測(cè)得含量的最高值,且準(zhǔn)確性也是最可靠的,因?yàn)橥ㄟ^(guò)間接測(cè)定葉綠素中鎂元素的濃度進(jìn)而測(cè)定葉綠素含量,在其過(guò)程中可以減少葉綠素的降解和損失問(wèn)題。但試驗(yàn)過(guò)程中也存在一些誤差,比如葉綠素提取液的制備采用的是研磨法,存在一定程度的光解。但是與其他方法相比,此方法所用的火焰原子吸收光光度計(jì)能夠靈敏可靠地測(cè)定鎂元素的吸光度,所以其準(zhǔn)確性仍是最高,誤差也最小。
3 結(jié)論與討論
在測(cè)定小麥葉綠素含量的6種方法中,原子吸收光譜法雖不是直接測(cè)定葉綠素含量的方法,但是其測(cè)定過(guò)程是對(duì)葉綠素中鎂元素進(jìn)行直接測(cè)定,測(cè)定鎂元素的吸光度與直接測(cè)定葉綠素吸光度相比,其操作過(guò)程不存在葉綠素的降解,所以它的測(cè)定結(jié)果是最可靠、最準(zhǔn)確的。無(wú)水乙醇浸提法所得結(jié)果較準(zhǔn)確但時(shí)間最長(zhǎng);葉綠素儀法是粗略估計(jì)但時(shí)間最短;研磨法是傳統(tǒng)方法且一直沿用至今,但是過(guò)程繁瑣,需耗時(shí)耗力。另外,浸提法、研磨法以及原子吸收光譜法都是對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行離體檢測(cè),在此過(guò)程中也存在對(duì)待測(cè)樣品不同程度的損傷,而葉綠素儀法則是活體檢測(cè),無(wú)需采摘;同時(shí)葉綠素儀法和原子吸收光譜法只能測(cè)出小麥的葉綠素總量,無(wú)法測(cè)出葉綠素a、葉綠素b含量。
葉綠素含量是所有植物十分重要的生理指標(biāo)之一[2],一直以來(lái)以傳統(tǒng)的研磨法應(yīng)用最為廣泛,深受各位研究者的青睞,本次研究也采用了研磨法,得知了其對(duì)葉綠素含量的影響,以及其他方法對(duì)含量測(cè)定的影響。
在研磨-過(guò)濾和研磨-離心2種方法的操作過(guò)程中,考慮到過(guò)濾法比較耗時(shí)和乙醇揮發(fā)較快的原因,所以同時(shí)做了離心試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),離心所測(cè)的含量比過(guò)濾法還要低。但總體來(lái)講,研磨法與其他方法相比,表現(xiàn)為步驟瑣碎、工作量大、在研磨過(guò)程中對(duì)小麥葉片易有損傷且很容易受光氧化分解,并且無(wú)法防止試驗(yàn)者不與揮發(fā)到四周空氣中的藥品接觸,對(duì)身體有較大的傷害[3]。所以,有人對(duì)此種方法進(jìn)行了改進(jìn)[4],但是由于對(duì)待測(cè)樣品的提取不徹底、效率低以及提取劑不穩(wěn)定等因素而未被廣泛使用[5]。所以研磨法從嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō),其測(cè)量結(jié)果偏低,也比較麻煩,并不適宜用來(lái)測(cè)定葉綠素含量,但是它作為測(cè)量植物葉綠素含量的鼻祖,必將會(huì)一直沿用下去,并且對(duì)于教師的試驗(yàn)教學(xué)過(guò)程還是比較適宜的。
用浸提法來(lái)進(jìn)行小麥葉綠素含量測(cè)定時(shí),使用了2種不同濃度的同一種提取劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度組所測(cè)的含量比較高且準(zhǔn)確。但這并不能說(shuō)明提取劑濃度與所測(cè)葉綠素含量表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系,如果未來(lái)有機(jī)會(huì),將會(huì)使用乙醇作為單一提取劑,作梯度濃度試驗(yàn),以確定最佳乙醇濃度。同時(shí)本試驗(yàn)與洪法水等的丙酮乙醇混合液作為浸泡液的試驗(yàn)[6]作比較,發(fā)現(xiàn)其效果相對(duì)偏低;與王文杰等的二甲基亞砜法浸泡提取葉片葉綠素相比[7],其時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。但是浸提法所測(cè)得的含量在6種方法當(dāng)中也是明顯較高的,且極易進(jìn)行操作,對(duì)試驗(yàn)也沒(méi)有藥品暴露風(fēng)險(xiǎn),個(gè)人覺(jué)得比較適合于本科及碩士課程的研究。
EYELHCM-1000葉綠素儀法作為一種測(cè)定植物相對(duì)葉綠素含量極其簡(jiǎn)便的方法,由于結(jié)果不準(zhǔn)確,故參考價(jià)值不大。但是此方法卻很簡(jiǎn)單易測(cè),并且儀器也很方便攜帶,同時(shí)也有研究表明,經(jīng)過(guò)校正的葉綠素儀能對(duì)田間生長(zhǎng)的植物的葉綠素含量進(jìn)行準(zhǔn)確快速的測(cè)定[8]。若待測(cè)植物的葉片面積可以達(dá)到儀器的要求,那么用來(lái)測(cè)量抽穗期的小麥葉片葉綠素含量還是比較適宜的。
原子吸收光譜法由于是一種間接的方法,很多人并不采用,但是由于其試驗(yàn)過(guò)程很?chē)?yán)謹(jǐn),對(duì)藥品的使用量有一定限度,只需把鎂元素從葉綠素中萃取出來(lái),它就不會(huì)有損失,如果采用直接方法測(cè)葉綠素含量,不可避免的會(huì)使待測(cè)液中葉綠素降解,導(dǎo)致含量降低。并且本試驗(yàn)結(jié)果也顯示它所測(cè)得的含量最高、最準(zhǔn)確,所以比較適用于科學(xué)研究。
參考文獻(xiàn):
[1]周小生,周月琴,龐 磊,等. 葉綠素儀CCM-200在測(cè)定茶樹(shù)葉片葉綠素和氮素含量上的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,39(1):150-153.
[2]徐芬芬,葉利民,徐衛(wèi)紅,等. 小白菜葉綠素含量的測(cè)定方法比較[J]. 北方園藝,2010(23):32-34.
[3]黃 帆,郭正元,徐 珍. 測(cè)定浮萍葉綠素含量的方法研究[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2007,24(5):29-31.
[4]陳福明,陳順偉. 混合法測(cè)定葉綠素含量的研究[J]. 林業(yè)科訊,1984(2):4-8.
[5]彭運(yùn)生,劉 恩.關(guān)于提取葉綠素方法的比較研究[J]. 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1992,18(3):247-250.
[6]洪法水,魏正貴,趙貴文. 菠菜葉綠素的浸提和協(xié)同萃取反應(yīng)[J]. 應(yīng)用化學(xué),2001,18(7):532-535.
[7]王文杰,賀海升,關(guān) 宇,等. 丙酮和二甲基亞砜法測(cè)定植物葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的方法學(xué)比較[J]. 植物研究,2009,29(2):224-229.
[8]張憲政. 植物葉綠素含量測(cè)定方法比較研究[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1985,16(4):81-84.