蓖麻高密度遺傳圖譜構(gòu)建親本SNP多態(tài)性分析

楊俊芳 曹越 王宙 王亞 張宏斌 趙宜婷 王宏偉

摘要：為了篩選最佳構(gòu)建蓖麻高密度遺傳圖譜的親本組合，以農(nóng)藝性狀差異較大的蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH3和HCH1分別為母本，基于全基因組重測序（WGS）技術(shù)和生物信息學分析方法對2組親本進行SNP標記多態(tài)性分析。結(jié)果表明，2組親本間多態(tài)性標記均比較豐富，其中以HCH1為母本的組合2的親本多態(tài)性更佳，SNP多態(tài)性標記總數(shù)為581 158個，可用aa×bb型SNP標記為181 791個。最佳親本組合的確定為構(gòu)建蓖麻的高密度遺傳圖譜、多種農(nóng)藝性狀定位和基因挖掘奠定了良好的基礎。

關(guān)鍵詞：蓖麻;全基因組重測序;親本;SNP;多態(tài)性分析

中圖分類號：S563.903.2 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0053-05

蓖麻（Ricinus communis L.，2n=20），屬于大戟科的單型蓖麻屬[1]，是雌雄同株異花植物，正常株蓖麻花序軸上方為紅色雌花，下方為黃色雄花，圓錐花序，常異花授粉，多級分枝，無限花期。蓖麻是一種重要的能源油料作物，因其蓖麻油具有的特殊物理性質(zhì)，被應用于航空、航天、軍工、工程塑料、化工、紡織等數(shù)十個行業(yè)[2]。但是受困于蓖麻傳統(tǒng)育種的局限性，在選擇具有理想性狀的植株，特別是多基因控制性狀時，需要很長時間且缺乏精確性，蓖麻品種改良進程緩慢。分子標記輔助育種（MAS）方法可以有效地解決這些問題。遺傳圖譜和數(shù)量性狀定位（QTL）已成為多種植物分子標記輔助育種的重要工具[3-8]。

在蓖麻上關(guān)于遺傳圖譜構(gòu)建的研究起步較晚，研究者也較少。國內(nèi)學者畢川等最早開始蓖麻圖譜構(gòu)建工作[9]，2016年構(gòu)建了第1張相對完整的遺傳圖譜[10]，共331個標記（317個SSR、7個SRAP標記、3個SSRAP標記、3個形態(tài)學標記、1個ISSR標記）分布在10個連鎖群上，覆蓋 1 164.73 cM 基因組，平均標記間隔為3.63 cM。2019年又新構(gòu)建了1張SSR標記遺傳圖譜并對蓖麻雌性復雜性狀進行了定位[11]。2016年Tomar等通過遺傳群體篩選出 141 個（RAPD、 ISSR、SSR）標記，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，找到了關(guān)于蓖麻抗枯萎病的2個 QTLs[12]。2017年Tomar等篩選出 336 個（RAPD、ISSR、SSR） 標記，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并定位到了與蓖麻木炭腐病相關(guān)的新型QTLs[13]。2019年Yu等基于GBS測序技術(shù)對200個重組自交系（RIL）群體進行測序分析，構(gòu)建了10個連鎖群（LGs）的高分辨率遺傳圖譜包含8 896個高質(zhì)量的SNPs，覆蓋1 852.33 cM基因組，篩選到了16個控制種子大小和質(zhì)量的QTLs[14]。

近年來，隨著第2代測序技術(shù)迅速發(fā)展和測序成本的降低，高通量測序技術(shù)為植物基因型鑒定和遺傳作圖帶來了方法上跨越式的突破[15]。以SNP 標記為代表的新一代分子標記大批量地用于植物高密度遺傳圖譜的構(gòu)建[16-19]。傳統(tǒng)的SSR、RAPD、AFLP、RFLP等分子標記上圖量少，標記間遺傳距離較大、基因組覆蓋率低，而SNP標記的上圖量遠遠超過傳統(tǒng)分子標記，圖譜分辨率高、定位精度高。蓖麻全基因組測序完成于2010年，形成了蓖麻的第1張基因草圖，基因組大小約350 M，組裝水平為Scaffold，Scaffolds有25 763條[20]。蓖麻測序工作的完成為開展蓖麻基因組水平的研究奠定了基礎，但是由于蓖麻基因組組裝水平并未到染色體，而且Scaffolds也比較多，組裝水平還遠遠落后于很多作物。據(jù)此可以借助構(gòu)建高密度遺傳圖譜的方法，對蓖麻的多種農(nóng)藝性狀進行QTL定位，挖掘相關(guān)基因，加快蓖麻分子標記輔助育種的進程。而且高密度的遺傳圖譜可以輔助基因組組裝，提高全基因組精細圖譜完整性。

本研究以農(nóng)藝性狀差異較大的蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH3和HCH1為母本分別構(gòu)建F1、F2、BC1群體?；谌蚪M重測序（WGS）技術(shù)和生物信息學分析方法對2組親本進行SNP標記多態(tài)性分析，以便篩選出最佳組合，為構(gòu)建蓖麻高密度遺傳圖譜奠定良好的基礎，進而對蓖麻多種農(nóng)藝性狀進行QTL定位和基因挖掘。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH1和HCH3為母本，2017年分別雜交收獲F1，2018年F1自交收獲F2、與母本回交收獲BC1。父本SL1為綠稈、密刺、中稈、早熟、花籽的正常兩性株，且雄花比例極大，單株主穗甚至無雌花，僅在分枝穗上有少量雌花。母本1：HCH3為紅稈、無刺、高稈、晚熟、小黑籽有極少量鑲嵌雄花雌性系。母本2：HCH1為紅稈、密刺、高稈、晚熟、小黑籽有少量鑲嵌雄花的雌性系。2019年5月將3個親本材料、F2及回交BC1群體種植于山西農(nóng)業(yè)大學（山西省農(nóng)業(yè)科學院）經(jīng)濟作物研究所，正常田間管理。

1.2 基因組DNA提取及測序

用剪刀取幼嫩蓖麻葉片0.1～0.5 g，用植物基因組DNA提取試劑盒（Solar Bio）提取每個樣品的基因組DNA。利用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀（Eppendorf公司，德國）檢測DNA濃度及純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。按照高通量測序的要求，每樣品的DNA總量≥1 μg，濃度≥50 ng/μL;樣品純度D260 nm/280 nm為1.8～2.0，D260 nm/230 nm為1.9～2.4。電泳結(jié)果主帶清晰，無降解，可用于高通量測序。檢驗合格的DNA樣品寄送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行建庫，并利用illumina HiSeqTM PE150進行測序。

1.3 信息分析方法

原始測序數(shù)據(jù)基于Raw data進行質(zhì)量評估，去除掉包含接頭信息、低質(zhì)量堿基、未測出的堿基（以N表示）等干擾信息，最終得到有效數(shù)據(jù)，即Clean data 或 Clean reads。經(jīng)質(zhì)控過濾后的有效測序數(shù)據(jù)通過 BWA 軟件（參數(shù)：mem-t4-k32-M）比對到蓖麻參考基因組（蓖麻全基因組數(shù)據(jù)庫TIGR，http：//castorbean.jcvi.org/downloads.php），比對結(jié)果經(jīng) SAMTOOLS 去除重復（參數(shù)：rmdup）。采用GATK等軟件進行群體SNP的檢測。

1.4 親本間標記開發(fā)

基于蓖麻親本基因型檢測結(jié)果，進行親本間多態(tài)性標記開發(fā)。過濾掉親本信息缺失的位點，篩選父母本間具有多態(tài)性的位點，并從中篩選出符合F2群體作圖標記類型的位點。用于F2群體作圖的標記類型為aa×bb型，篩選父母本都為純合且親本間具有多態(tài)性的位點，即在某個SNP位點親本1基因型為GG，親本2基因型為AA，親本基因型都為純合，且親本間基因型不相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及質(zhì)量評估

對經(jīng)過嚴格質(zhì)控過后的親本測序數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計（表1），可以看出母本2的堿基數(shù)最大，達到了947×109 bp。父本次之，為8.64×109 bp。母本1的堿基數(shù)最少，為8.58×109 bp。3個親本的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)量均達到了99.8%以上，測序錯誤率同為004%，Q20、Q30、GC含量也達到了測序要求。最終獲得了高質(zhì)量的Clean data，能夠順利進行下一步的比對工作。

2.2 Reads與參考基因組比對情況

蓖麻參考基因組大小為 336 968 299 bp。3個親本的比對率在98%以上，對參考基因組（排除N區(qū)）的平均覆蓋深度在20X以上，1X覆蓋深度（至少有1個堿基覆蓋）95.73%及以上，4X覆蓋深度（至少有4個堿基覆蓋）在92.35%及以上。親本比對結(jié)果正常（表2），可用于后續(xù)的變異檢測及多態(tài)性分析。

2.3 親本SNP檢測結(jié)果

將比對到蓖麻基因組上的reads挑選出來，采用 GATK對數(shù)據(jù)進行群體SNP的檢測，統(tǒng)計得到的SNP相關(guān)信息。父本和母本2的SNP標記總數(shù)和純合標記數(shù)量均高于母本1。親本SNP檢測結(jié)果見表3。

2.4 標記多態(tài)性分析

以父本SL1和母本HCH3（母本1）為雜交組合1構(gòu)建F2群體，多態(tài)性標記總數(shù)為542 928個，可用aa×bb型標記為171 829個（表4）。以父本SL1和母本HCH1（母本2）為雜交組合2構(gòu)建F2群體，多態(tài)性標記總數(shù)為581 158個，可用aa×bb型標記為181 791個（表5）。通過2個雜交組合間不同類型標記數(shù)量比較，可見由父本SL1和母本HCH1（母本2）搭配的組合2的總標記數(shù)和可用型標記數(shù)都較優(yōu)。這與田間觀察到的表型性狀分離情況也一致，組合2構(gòu)建的F2群體、BC1群體分離的多樣性比組合1更豐富。同時，通過表4和表5明顯看出aa×bb型標記并不是最多的標記，hk×hk類型標記最多，超過25萬個，在組合1中同樣存在類似的問題。由于hkxhk與nnxnp、lmxll型標記均適用于由雜合親本構(gòu)建的F1作圖群體。而本試驗的親本均為純合，且構(gòu)建的為F2作圖群體，故同一組合間不同標記數(shù)量的比較沒有太大的參考價值，本試驗僅對不同組合間的同一aa×bb型標記進行比較分析。

3 討論與結(jié)論

在構(gòu)建遺傳圖譜前首先要確定親本組合，若親本材料選取不當， 會直接影響圖譜的質(zhì)量以及準確性[21]。傳統(tǒng)遺傳圖譜構(gòu)建親本組合的確定，需經(jīng)過分子標記多態(tài)性篩選[22-25]，高密度遺傳圖譜構(gòu)建親本的選擇同樣也需要進行標記多態(tài)性分析。

2018年花生上基于WGS技術(shù)對2個親本及91個RIL群體進行測序，構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間總的SNPs標記數(shù)為97 571個，可用多態(tài)性SNPs標記為18 252個，最終上圖標記數(shù)為8 869個，覆蓋3 120 cM基因組，平均遺傳距離1.45 cM[26]。2018年大豆上基于SLAF測序技術(shù)對親本和149株RILs個體進行測序，構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間總的SNPs標記數(shù)為391 476個，可用多態(tài)性SNPs標記為53 132個，最終上圖標記數(shù)為5 111個，覆蓋 2 909.46 cM 基因組，平均遺傳距離0.57 cM[27]。2019年在胡蘿卜上基于WGS技術(shù)對2個親本及137個F2群體進行測序，構(gòu)建了超高密度遺傳圖譜，親本間可用多態(tài)性SNPs標記為411 891個，最終上圖標記為378 738個，覆蓋1 306.8 cM基因組，平均遺傳距離0.46 cM[28]。2020年在煙草上基于WGS技術(shù)構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間可用多態(tài)性SNPs標記為1 626 811個，最終上圖標記為 45 081 個，遺傳距離為3 486.78 cM，平均遺傳距離0.495 cM[29]。本研究中獲得的組合1親本間多態(tài)性標記總數(shù)為542 928個，可用多態(tài)性標記為 171 829 個;組合2親本間多態(tài)性標記總數(shù)為 581 158 個，可用多態(tài)性標記為181 791個。最終的上圖標記量還需要經(jīng)過對F2群體多態(tài)性標記分析，之后再過濾掉一部分缺失的、偏分離的標記才能確定。但是目前來看，通過2組親本間的可用多態(tài)性標記分析，進一步對2個組合子代F2群體進行重測序均是可行的。相比較而言，組合2優(yōu)于組合1。

在群體構(gòu)建親本選擇恰當?shù)幕A上，通過高通量測序獲得的SNP標記構(gòu)建的圖譜質(zhì)量一般要遠高于傳統(tǒng)標記圖譜。然而通過選擇不同的測序技術(shù)、測序群體種類和大小獲得的圖譜質(zhì)量會有很大差異。測序方法上常用到的有全基因組測序和簡化基因組測序，簡化基因組測序技術(shù)根據(jù)文庫構(gòu)建的不同原理又分為RAD、GBS、2b-RAD、ddRAD、SLAF測序技術(shù)[30]。理論上同一群體利用全基因組測序比簡化基因組測序獲得的圖譜質(zhì)量更高。但全基因測序的方法在成本上比簡化基因組測序要高很多，因此簡化基因組測序要比全基因組測序應用得更多。近年來玉米[31]、大豆[32]、花生[33]、芝麻[34]、紅豆[35]、向日葵[36]、甜瓜[37]等多種作物均有用簡化測序技術(shù)的研究成果。蓖麻基因組相對于其他作物較小，在測序成本方面利用全基因組測序技術(shù)相比其他作物更具有優(yōu)勢。

本研究通過對3個親本的全基因重測序及親本間的標記多態(tài)性分析表明，2組親本間多態(tài)性標記都比較豐富，均可用來作為構(gòu)建高密度遺傳圖譜的親本。組合1親本多態(tài)性標記總數(shù)為542 928個，可用aa×bb型標記為171 829個。組合2親本多態(tài)性標記總數(shù)為581 158個，可用aa×bb型標記181 791。經(jīng)比較確定了以SL1為父本和HCH1為母本的組合2為最佳親本組合。最佳親本的確定為構(gòu)建蓖麻的高密度遺傳圖譜及進行多種農(nóng)藝性狀定位和基因挖掘奠定了良好的基礎。

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