自制毛囊再生乳膏對小鼠皮膚創(chuàng)面毛囊再生的影響

孫 浩，湯 茂，孫夢黎，秦 華，馬 奎1,，梅謹瑜，趙安東，付小兵,4

1 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部 創(chuàng)傷修復和組織再生研究中心，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心 全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室 皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京100048；3 天津醫(yī)科大學，天津 300070；4 中國醫(yī)學科學院 嚴重創(chuàng)傷救治和組織修復與再生醫(yī)學創(chuàng)新單元，北京 100048；5 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 組織再生與創(chuàng)面修復科，北京 100853

皮膚是人體最大的器官，易遭受外界因素的損傷。人體皮膚在遭受大面積創(chuàng)(燒)傷后，瘢痕愈合時缺失毛發(fā)等皮膚附屬器，其中毛發(fā)難以再生是創(chuàng)面愈合時面臨的主要問題之一。毛發(fā)的發(fā)育和生長依賴于毛囊中皮芽基細胞和真皮毛乳頭的相互調(diào)控[1]。而在創(chuàng)面愈合過程中，這種上皮-間質(zhì)調(diào)控關系遭到破壞。因此，重建毛囊上皮-真皮間質(zhì)細胞的相互調(diào)控網(wǎng)絡，是促進創(chuàng)面愈合時毛囊再生的突破點。大量研究發(fā)現(xiàn)，毛囊的發(fā)育和再生過程主要受到Wnt信號通路、Shh信號通路以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路的調(diào)控[1-6]。對上述信號通路進行人為干預可促進受損皮膚愈合過程中毛囊再生。CHIR-99021是一種氨基嘧啶衍生物，可有效激活Wnt/β-catenin 信號通路，廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生和周期性生長的各個環(huán)節(jié)，也常用于誘導體細胞重編程的相關研究[7]。Purmorphamine是一種嘌呤衍生物，也是一種新型小分子平滑受體 (smoothened receptor，Smo) 激動劑，能夠取代Shh與Smo結合從而促進Shh信號通路的表達，參與毛囊生長發(fā)育調(diào)控和毛囊干細胞的維持[8]。托法替尼是一種小分子JAK激酶(Janus kinase，JAK)抑制劑，具有抗炎作用，也可用于促進毛囊干細胞活化[9]。SJ000291942是一種人工合成的乙酰氨基類小分子化合物，可靶向激活BMP信號傳導通路，參與調(diào)控毛囊周期性生長和毛囊基板形成，促進毛乳頭細胞再生[10]。本研究將上述小分子化合物組合制備成藥膏(以下簡稱毛囊再生乳膏)，涂抹于成年小鼠背部皮膚全層缺損創(chuàng)面，探討其誘導毛囊再生的可能性及相關機制，為創(chuàng)面修復過程中毛囊再生的藥物研究提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物 SPF級的健康C57BL/6小鼠45只，雌性，體質(zhì)量(20±5) g，8周齡，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK (京)2019-0010。飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境(溫度20℃ ～ 23℃，濕度50%～60%)。

2 主要試劑和儀器 小分子化合物CHIR-99021、Purmorphamine、Tofacitinib 和SJ000291942 (Med-ChemExpress公司，美國)；凡士林(寧建醫(yī)療器械，中國)；蘇木精-伊紅染色(HE)染色試劑盒和Masson染色試劑盒(索萊寶生物技術有限公司，北京)；中性樹膠(中杉金橋生物技術有限公司，北京)；一抗：抗細胞角蛋白5(cytokeratin 5，CK5)、抗細胞角蛋白15(cytokeratin 15，CK15)、抗細胞角蛋白(cytokeratin 17，CK17)、抗β-catenin、抗頭蛋白(Noggin)(Abcam，英國)；抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1(TGase 1)、抗音猬因子蛋白(Shh)(Santa Cruz，美國)；抗波形蛋白(Vimentin)(Cell Signaling Technology公司，美國)、抗α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(Sigma公司，德國)；抗Gli家族鋅指蛋白1(Gli1)(博士德，中國)；抗外皮蛋白(Involucrin)(Biolegend，美國)。熒光二抗：Alexa488和Alexa594(索萊寶生物技術有限公司，北京)。普通光學顯微鏡(Olympus公司，日本)、普通熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描熒光顯微鏡(Leica公司，德國)。

3 毛囊再生乳膏的制備 用不同劑量的二甲亞砜(DMSO)分別溶解小分子化合物CHIR-99021、Purmorphamine、Tofacitinib、SJ000291942，制備成4種化合物母液。取適量凡士林裝入50 mL離心管內(nèi)，放入65℃烘箱烘烤至融化。量取1 mL凡士林裝入EP管內(nèi)，依次加入配制好的4種化合物母液并迅速混勻，冷卻后的成品藥膏中含有4種小分子化合物，各化合物終濃度見表1。對照組空白藥膏制備：僅向凡士林中加入同劑量的DMSO，無其他化合物成分。毛囊再生乳膏在處理創(chuàng)面前臨時制備，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 四種化合物母液濃度及藥膏終濃度Tab.1 Solution concentrations of the four compounds and concentration of the ointment

4 小鼠皮膚缺損模型制作與分組處理 取45只健康雌性C57BL/6小鼠，用1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉后，脫去小鼠背部皮膚毛發(fā)，并以脊柱為中線，兩側(cè)用直徑為6 mm的圓形打孔器打孔，再用眼科剪進行修整，剪去多余組織，形成直徑為6 mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。每只小鼠背部左側(cè)創(chuàng)面為用藥組，右側(cè)創(chuàng)面為對照組。造模后即刻，在左側(cè)創(chuàng)面上涂抹約100 μL毛囊再生乳膏，在右側(cè)創(chuàng)面涂抹等量空白藥膏，兩側(cè)創(chuàng)面每天涂抹1次，連續(xù)涂抹28 d。造模后7 d、14 d、21 d、28 d隨機選取10只小鼠進行取材，剩余5只小鼠作為替補，以防參與實驗的小鼠中途死亡。將小鼠單籠喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。

5 創(chuàng)面愈合率計算 造模后每兩天用數(shù)碼相機拍照背部創(chuàng)面，取第3 d、5 d、7 d、9 d、11 d小鼠背部創(chuàng)面照片，用ImageJ軟件進行分析，每個時間點隨機選取10只小鼠，分別計算用藥組與對照組創(chuàng)面愈合率：

創(chuàng)面愈合率 =(創(chuàng)面初始面積-術后第n天的面積)/ 創(chuàng)面初始面積×100%。

6 常規(guī)組織病理學觀察 造模成功后7 d、14 d、21 d、28 d采用脫頸法分別處死10只小鼠，取左右兩側(cè)創(chuàng)面組織，各放入預先標記的組織收集瓶中，迅速加入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液固定，按常規(guī)石蠟切片方法進行脫水透明、浸蠟、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)。將組織切片在65℃烘箱內(nèi)烤片2 h、脫蠟至水，行常規(guī)HE染色和Masson染色，觀察創(chuàng)面愈合及毛囊生長情況。

7 免疫熒光染色 將組織切片常規(guī)脫蠟至水后置于檸檬酸鈉抗原修復液中微波修復。用5%山羊血清封閉液封閉30 min。去除封閉液，分別加入一抗，包括抗CK5、CK15、CK17、抗β-catenin、抗Noggin、抗TGase 1、抗Shh、抗Vimentin、抗α-SMA、抗Gli1、抗Involucrin 4℃過夜。磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入Alexa 488和Alexa 594熒光二抗(1∶400)，室溫孵育1 h后磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入DAPI染色液進行染色10 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次。用中性樹脂封片，熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描熒光顯微鏡下拍照記錄，觀察表皮細胞分化、創(chuàng)面皮下纖維化、毛囊細胞特征性標志物Involucrin、TGase1、α-SMA、CK17、CK15、Noggin等表達等情況。

8 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示。兩組資料分別在不同時間點采用t檢驗比較。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 實驗動物情況 45只小鼠中，3只于造模當天因麻醉過量死亡，1只于造模后第1天死亡；剩余41只小鼠隨機選擇1只退出實驗。參與實驗的小鼠共計40只。

2 創(chuàng)面愈合率 造模后3 d左右，用藥組和對照組創(chuàng)面均開始收縮。造模后7 d左右在創(chuàng)面開口處肉眼可見新生上皮組織，兩側(cè)無明顯差異(圖1A)。造模后11 d，兩側(cè)創(chuàng)面均趨于愈合，用藥組與對照組的創(chuàng)面愈合率差異在各時間點均無統(tǒng)計學意義(P ＞ 0.05)，見圖1B。

圖1 毛囊再生乳膏處理創(chuàng)面后皮膚愈合情況 A：造模后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d拍照。左側(cè)創(chuàng)面為用藥組，用毛囊再生乳膏涂抹，右側(cè)創(chuàng)面為對照組，用空白藥膏涂抹；B：造模后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d創(chuàng)面愈合率比較，用藥組與對照組創(chuàng)面愈合率在各時間點均無統(tǒng)計學差異(每個時間點n=10)Fig.1 Skin healing after hair follicle regeneration ointment treatment A: On day 3, 5, 7, 9, 11 after surgery, the left side of back skin was treated with small molecule-based ointment, and the right side of back skin was treated with control ointment; B: Comparison of wound healing rate on day 3, 5, 7, 9, 11 after surgery showed that there was no statistical difference in the wound healing rates between the treatment group and the control group at each time point (n=10 for each time point)

3 常規(guī)組織病理學觀察 HE染色顯示，造模后14 d用藥組和對照組創(chuàng)面新生表皮細胞均覆蓋創(chuàng)面，新生表皮層厚度、上皮細胞大小形態(tài)和排列無明顯區(qū)別(圖2A)。用藥組創(chuàng)面表皮層細胞向下長出毛囊上皮芽基細胞，毛囊上皮芽基細胞底部長出新生的毛乳頭細胞，部分毛囊周圍還可見皮脂腺；而對照組創(chuàng)面表皮細胞向下長出毛囊上皮芽基細胞的情況較罕見，未見毛乳頭樣結構，且新生毛囊數(shù)量極少(圖2A)。用藥組與對照組新生毛囊數(shù)量在14 d、28 d均有統(tǒng)計學差異(圖2B)。這些結果表明毛囊再生乳膏能夠誘導全層皮膚缺損創(chuàng)面的毛囊再生。Masson染色發(fā)現(xiàn)，用藥組與對照組創(chuàng)面皮下膠原纖維排列方式、密度、形態(tài)等特征無明顯差異，且用藥組新生的毛囊和毛乳頭細胞生長在創(chuàng)面瘢痕中(圖3)。以上表明毛囊再生乳膏促進創(chuàng)面毛囊再生與周圍的瘢痕沒有明顯的關系。

圖2 HE染色分析創(chuàng)面愈合和毛囊再生情況 A：黑色箭頭示新生的毛囊上皮芽基細胞，造模后28 d用藥組毛囊再生明顯，對照組無明顯毛囊再生(標尺=100 μm)；B：實驗組與對照組新生毛囊數(shù)量14 d、28 d時差異有統(tǒng)計學意義 (aP ＜ 0.001)Fig.2 HE staining analysis of wound healing and hair follicle regeneration A: Black arrows indicates the de novo hair epithelial germ cells(scale bar=100 μm); B: There are statistically significant differences in the number of new hair follicles between the experimental group and the control group on day 14 and 28 (aP ＜ 0.001)

圖3 Masson染色分析創(chuàng)面纖維化瘢痕形成情況。用藥組與對照組創(chuàng)面膠原纖維排列方式、膠原纖維密度等特征無顯著差異(標尺=100 μm)Fig.3 Masson staining analysis of wound fibrosis.There is no significant difference between the treatment group and the control group in the pattern of collagen fiber arrangement and density of collagen fiber (scale bar=100 μm)

4 免疫熒光染色觀察 免疫熒光染色顯示，兩側(cè)創(chuàng)面表皮上層細胞在14 d均開始表達表皮細胞分化相關標志物Involucrin和TGase1(圖4A，圖4B)，表皮基底層在造模后7 d、14 d、28 d均表達表皮干細胞的標志物CK5，用藥組與對照組無明顯差異(圖5)，表明毛囊再生乳膏對表皮細胞的發(fā)育無明顯影響。用藥組與對照組肌成纖維細胞標志物α-SMA的表達情況在造模后7 d、14 d、28 d均無顯著差異(圖5)，說明毛囊再生乳膏對創(chuàng)面瘢痕增生無明顯抑制作用。造模后14 d，用藥組新生的毛囊上皮芽基細胞表達其特征性標志物CK17(圖6A)、毛囊細胞特征性標志物CK15(圖6B)。新生毛乳頭細胞表達其特征性標志物Noggin(圖6C)。而對照組未見CK17、CK15、Noggin顯色，進一步證實了毛囊再生乳膏對小鼠皮膚創(chuàng)面毛囊再生的促進作用。

圖4 造模后14 d免疫熒光染色分析創(chuàng)面表皮細胞分化標志物Involucrin (A)和TGase1 (B)。綠色熒光為表皮細胞，藍色熒光為細胞核(標尺=25 μm)Fig.4 Immunofluorescence staining for epidermal cell differentiation-associated markers Involucrin (A) and TGase 1 (B) on day 14 after surgical operation.Epidermis cell is green, and the cell nucleus is blue (scale bar=25 μm)

圖5 創(chuàng)面表皮干細胞、毛囊上皮芽基細胞標志物CK5和肌成纖維細胞標志物α-SMA表達變化情況免疫熒光分析。綠色為表皮細胞、毛囊上皮芽基細胞。紅色為肌成纖維細胞。藍色為細胞核(標尺=25 μm)Fig.5 Immunofluorescence staining for the hair epithelial germ cell and epidermal stem cell marker CK5 and myofibroblastspecific marker α-SMA.Epidermis cell and hair epithelial germ cell is green, myofibroblast is red, and cell nucleus is blue (scale bar=25 μm)

圖6 造模后14 d免疫熒光染色分析創(chuàng)面毛囊上皮芽基細胞標志物CK17 (A)、毛囊細胞特征性標志物CK15 (B)和毛乳頭細胞標志物Noggin (C)。A中箭頭處為新生的毛囊上皮芽基細胞，C中箭頭處為毛乳頭細胞(標尺=25 μm)Fig.6 Immunofluorescence staining for hair epithelial germ cell marker CK17(A), hair follicle cell marker CK15(B), and dermal papilla cell marker Noggin (C) on day 14 after surgical operation.White arrows in A indicates the de novo hair epithelial germ cells, and in C indicates the de novo dermal papilla cells (Scale bar=25 μm)

5 毛囊再生乳膏對Wnt、Shh信號通路的作用免疫熒光染色顯示，造模14 d后用藥組創(chuàng)面新生的表皮細胞、毛囊上皮芽基細胞、新生毛乳頭細胞中Wnt信號通路下游關鍵蛋白β-catenin顯色明顯，并且在部分表皮細胞、毛囊芽基細胞胞核處可見綠色熒光顯色，這表明β-catenin表達水平上調(diào)，且已轉(zhuǎn)移到細胞核；而對照組創(chuàng)面表皮層βcatenin表達較弱，且未進入細胞核，創(chuàng)面組織中未見β-catenin陽性的毛囊芽基細胞或毛乳頭細胞(圖7A)。用藥組創(chuàng)面新生的毛囊上皮芽基細胞和毛乳頭細胞中Shh信號通路的重要配體Shh以及下游因子Gli1顯色明顯，提示Shh、Gli1表達水平上調(diào)(圖7B，圖7C)，而對照組Shh、Gli1表達均不明顯。這提示著毛囊再生乳膏可能通過激活Wnt、Shh信號通路促進毛囊再生。

圖7 造模后14 d免疫熒光染色分析Wnt信號通路下游關鍵蛋白β-catenin (A)表達情況、Shh信號通路的配體Shh (B)和下游關鍵因子Gli1 (C)表達情況。A、B中表皮細胞、毛囊上皮芽基細胞、毛乳頭細胞顯示為綠色，箭頭處為毛囊上皮芽基細胞。C中箭頭處為毛乳頭細胞，Gli1高表達。藍色為細胞核(標尺=25 μm)Fig.7 Immunofluorescence staining for the Wnt signaling downstream factor β-catenin (A) and the Shh signaling ligand Shh(B) and its downstream factor Gli1 (C).Epidermis cell, hair epithelial germ cell and dermal papilla cell in A and B is green, white arrows indicates the hair epithelial germ cell.White arrows in C indicates the dermal papillas, which express Gli1 strongly.Cell nucleus is blue in A, B, C (scale bar=25 μm)

討 論

毛囊、皮脂腺和汗腺等皮膚附屬器再生是損傷皮膚完美修復的必要條件。尤其是毛囊的再生，不僅對創(chuàng)面愈合十分重要，對治療高發(fā)生率的禿發(fā)也具有重要意義[9]。毛囊的發(fā)育和再生需要形成毛囊上皮芽基細胞和真皮毛乳頭細胞，并且需要二者持續(xù)相互調(diào)控。Wnt信號通路、Shh信號通路在毛囊發(fā)育和再生過程起著關鍵性作用。在創(chuàng)面表皮細胞中激活Wnt信號通路能夠誘導毛囊上皮芽基細胞形成和毛囊的再生[3]。Wnt信號通路激活還能誘導真皮成纖維細胞分化為毛乳頭細胞，并維持真皮毛乳頭細胞引導毛囊形成的能力[6,11-13]。在創(chuàng)面表皮細胞中，Shh的過度表達能夠誘導毛囊芽基細胞形成和毛囊的再生，毛囊上皮芽基細胞和真皮毛乳頭細胞均能分泌Shh蛋白，從而激活Shh信號通路，形成正反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，誘導毛囊上皮芽基細胞向下持續(xù)生長[1,14]。真皮層中Shh的過度表達也能誘導成纖維細胞分化為毛乳頭細胞，促進毛囊再生[15]。BMP信號通路的表達能誘導真皮成纖維細胞重編程為毛乳頭細胞[13]。本研究利用小分子化合物CHIR-99021激活Wnt信號通路；Purmorphamine激活Shh信號通路；SJ000291942促進成纖維細胞再分化為毛乳頭細胞；Tofacitinib通過抑制JAK/STAT信號通路，輔助激活Wnt和Shh信號通路，活化毛囊干細胞[9,16]。這些小分子化合物重建了創(chuàng)面愈合過程中毛囊再生的信號調(diào)控網(wǎng)絡。

本研究選擇了成年小鼠背部皮膚全層缺損的小面積創(chuàng)面，這是因為大面積創(chuàng)面(＞2 cm2)能夠誘發(fā)創(chuàng)面中心部分再生少量毛囊，影響實驗結果，而小面積創(chuàng)不會誘發(fā)毛囊再生[17]。本研究中，對照組毛囊再生數(shù)量極少，而用藥組創(chuàng)面新生出較多毛囊，其周圍還有新生皮脂腺。胎兒皮膚創(chuàng)面不易留瘢痕，但成年后容易留瘢痕，因此有學者提出纖維化是抑制皮膚附屬器再生的重要因素[18]。本研究發(fā)現(xiàn)新生的毛囊和皮脂腺生長于瘢痕中，這表明瘢痕可能不是抑制毛囊再生的最重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路下游關鍵因子β-catenin在細胞質(zhì)和細胞核積累，說明毛囊再生乳膏激活Wnt信號通路是形成毛囊上皮芽基細胞的重要因素。我們也觀察到了Wnt信號通路在新生的真皮毛乳頭細胞中激活。這與Wnt信號通路調(diào)控毛囊上皮芽基細胞命運和維持毛乳頭細胞引導毛囊再生能力的相關研究報道結果一致[11-13]。Lim等[1]報道Shh信號通路在創(chuàng)面表皮細胞中過表達，可促使創(chuàng)面瘢痕中再生出毛囊，這也說明瘢痕不是阻礙毛囊再生的關鍵因素。

Shh信號通路激活是促進毛囊上皮芽基細胞形成和持續(xù)生長的關鍵。通過免疫熒光和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)在新生的毛囊上皮芽基細胞中Shh表達水平明顯增加。在新生的真皮毛乳頭細胞中，同樣檢測到Shh表達上調(diào)。說明毛囊再生乳膏可增強Shh信號通路表達，調(diào)控毛囊上皮芽基細胞和真皮毛乳頭細胞形成。這與Purmorphamine和Tofacitinib能夠激活Shh信號通路相吻合[9,19]。重建毛囊上皮芽基細胞和毛乳頭細胞是毛囊再生的必備條件。我們推測小分子化合物CHIR-99021、Purmorphamine和Tofacitinib在創(chuàng)面表皮細胞中激活了Wnt信號通路和Shh信號通路，誘導創(chuàng)面新生表皮細胞再分化為毛囊上皮芽基細胞。而在真皮中CHIR99021、SJ000291942、Purmorphamine和Tofacitinib誘導真皮成纖維細胞向毛乳頭細胞分化，從而再生出真皮毛乳頭細胞。有研究報道在體外激活Wnt和BMP信號通路能誘導真皮成纖維細胞向毛乳頭細胞重編程[11-13,20]。激活創(chuàng)面真皮層Shh信號通路可促使成纖維細胞分化為毛乳頭細胞[1]。這些研究支持了我們的推測。

綜上，本研究通過制備毛囊再生乳膏促進創(chuàng)面愈合過程中毛囊再生。鑒于其便捷性和使用安全性，有望進一步轉(zhuǎn)化為創(chuàng)面治療藥物應用于臨床。本研究認為，通過調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中的關鍵信號通路實現(xiàn)原位重編程獲取皮膚再生所需的種子細胞，或許可達到皮膚及附屬器再生的目的。