超高壓誘導(dǎo)β-乳球蛋白-殼聚糖共價(jià)復(fù)合物及其穩(wěn)定乳狀液的制備與表征

任 爽，何曉葉，劉錦芳，毛立科，高彥祥，袁 芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

超高壓是一種非熱食品加工技術(shù)，具有處理溫度低、食品營(yíng)養(yǎng)成分及色香味損失少、處理效率高、能耗少等優(yōu)點(diǎn)，近年來在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用[1]。其可以通過影響蛋白質(zhì)的分子體積、非共價(jià)鍵等，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，誘導(dǎo)多肽聚集和解離，改變其表面疏水性、溶解性等理化性質(zhì)[2]，進(jìn)而用于改善蛋白質(zhì)的功能特性，特別是乳化特性。例如Manassero等[3]發(fā)現(xiàn)，超高壓處理改善了添加鈣和大豆蛋白的桃汁的物理穩(wěn)定性；Li Chunlin等[4]發(fā)現(xiàn)超高壓減少了食品加工過程中非酶促褐變的發(fā)生。當(dāng)超高壓處理與非熱加工或熱加工相結(jié)合時(shí)，肽和蛋白質(zhì)會(huì)與還原糖發(fā)生反應(yīng)，從而改變食品特性[5]。

研究表明，蛋白質(zhì)與多糖分子發(fā)生共價(jià)復(fù)合反應(yīng)（糖基化反應(yīng)或美拉德反應(yīng)）的產(chǎn)物更易吸附在油-水界面上，從而增強(qiáng)界面膜機(jī)械強(qiáng)度和液滴間排斥力，提高乳狀液的穩(wěn)定性[6]。但在傳統(tǒng)干熱條件下，由于水分活度較低，蛋白質(zhì)與多糖的共價(jià)復(fù)合反應(yīng)速率較慢，耗時(shí)長(zhǎng)。鑒于此，有研究者將超高壓技術(shù)應(yīng)用到蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合反應(yīng)中，以改變生物大分子的理化特性（如外觀狀態(tài)、流變特性和凝膠特性等）[7-8]。例如Buckow等[9]發(fā)現(xiàn)，超高壓（0.1～600 MPa）處理在牛血清白蛋白-葡萄糖模型系統(tǒng)中抑制了美拉德反應(yīng)。Schwarzenbolz等[10]發(fā)現(xiàn)，超高壓（0.1～600 MPa）處理會(huì)減慢賴氨酸和乙二醛系統(tǒng)中氨基的衍生化作用。Ruiz等[11]發(fā)現(xiàn)超高壓（700 MPa）處理可以改善含蛋白質(zhì)-糖復(fù)合物飲料的品質(zhì)，但產(chǎn)品的黏度不理想。盡管有些報(bào)道的結(jié)果模棱兩可，但是超高壓確實(shí)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和美拉德反應(yīng)有強(qiáng)烈影響[12]。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是牛乳乳清蛋白中的主要成分，其水解物質(zhì)或分子修飾物具有降膽固醇與抗氧化等生理活性[13]。有研究表明，β-Lg和阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、鼠李糖和核糖通過美拉德反應(yīng)明顯改善了其溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性和起泡性[14]。殼聚糖（chitosan，CS）具有良好的生物相容性、吸濕性和保濕性、明顯的抗菌抑菌性、表面多孔性等，在化學(xué)改性方面受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。Babiker[15]應(yīng)用CS與小麥面筋蛋白短肽進(jìn)行共價(jià)復(fù)合，不僅提高了CS的溶解性與乳化性，而且還改善了CS的抑菌效果。Miralles等[16]研究發(fā)現(xiàn)，β-Lg與CS的共價(jià)復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物具有比CS更好的抑制大腸桿菌能力。

基于以上研究，可以推測(cè)β-Lg和CS能夠通過超高壓誘導(dǎo)發(fā)生美拉德反應(yīng)，并且產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生一定變化。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu)及其制備乳液的粒徑、Zeta-電位、物理穩(wěn)定性等進(jìn)行表征，研究超高壓處理對(duì)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能的影響，為蛋白-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋食品活性物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-Lg（食品級(jí)，純度≥95%） 美國(guó)Dacisco有限公司；CS（醫(yī)藥級(jí)，脫乙酰度90.16%） 浙江金殼生物化學(xué)有限公司；冰醋酸、醋酸鈉、疊氮化鈉（均為分析純）北京化學(xué)試劑公司；溴化鉀（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑（均為分析純） 北京化工廠；芥花籽油 加拿大Canola Harvest公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140分析天平 上海奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器 江蘇榮華儀器制造有限公司；Orion Star pH計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；DZ-260B真空包裝機(jī) 北京愷欣世紀(jì)科技有限公司；L2-700/1超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Pistar π-180圓二色光譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制造；Q1-866漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；T25-digital高速剪切分散器 德國(guó)IKA公司；NS1001L2K型高壓均質(zhì)機(jī) 意大利Niro-Soavi公司；Zetasizer Nano-ZS90粒度電位儀 英國(guó)Malvern公司；Turbiscan AGS全能穩(wěn)定性分析儀 法國(guó)Formulaction公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓誘導(dǎo)β-Lg與CS共價(jià)復(fù)合物的制備

稱取一定質(zhì)量的β-Lg和CS粉末分別溶解于醋酸緩沖溶液（pH 4，50 mmol/L）中，室溫下攪拌2～3 h至完全溶解，放入4 ℃冰箱中過夜溶脹。將溶解好的β-Lg（2 g/100 mL）和CS（2 g/100 mL）溶液按一定質(zhì)量比例混合（1∶1、1∶2和1∶4），并加入0.1 g/L的疊氮化鈉作為抑菌劑。將混合溶液在磁力攪拌器上攪拌2～3 h至混合完全。將制備好的β-Lg-CS混合溶液裝入聚乙烯袋中，用真空包裝機(jī)抽真空密封，置于超高壓設(shè)備的壓力腔內(nèi)，并完全浸沒于傳壓介質(zhì)（去離子水）中，設(shè)置壓力和時(shí)間參數(shù)后進(jìn)行超高壓處理。壓力分別設(shè)置為200、400、600 MPa，時(shí)間為20 min，選取常壓（0.1 MPa）作為對(duì)照。升壓速率和降壓速率分別為6.5 MPa/s和20 MPa/s。

將高壓處理前后的溶液真空冷凍干燥，將凍干粉置于底部盛有飽和KBr（相對(duì)濕度79%）的干燥器中，在55 ℃烘箱中反應(yīng)16 h。將制備得到的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物置于－20 ℃冰箱中儲(chǔ)存。將制得的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物溶于50 mmol/L pH 4的醋酸緩沖溶液中，配制成蛋白質(zhì)量濃度2 g/L的溶液，用于后續(xù)的分析測(cè)定。β-Lg與CS物理混合物只經(jīng)過混合攪拌處理，沒有抽真空、超高壓及干熱處理過程。

1.3.2 超高壓誘導(dǎo)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物褐變程度分析

取一定量的共價(jià)復(fù)合物溶液，以β-Lg與CS物理混合物作為對(duì)照，分別在294 nm和420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度。

1.3.3 超高壓誘導(dǎo)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析

1.3.3 .1β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物紫外-可見吸收光譜分析

將制得的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物溶于50 mmol/L pH 4的醋酸緩沖溶液中，配制成蛋白質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液。以β-Lg與CS物理混合物作為對(duì)照，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品在250～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度（間隔1 nm），繪制紫外吸收光譜圖。

1.3.3 .2β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物熒光光譜分析

參考Sun Cuixia等[17]的方法，取一定量的共價(jià)復(fù)合物溶液，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為300～450 nm，以1 200 nm/min的掃描速率記錄熒光強(qiáng)度的變化。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，電壓為550 V，以β-Lg與CS物理混合物作為對(duì)照，以相應(yīng)的緩沖溶液作為空白。

1.3.3 .3β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物圓二色光譜分析

參考Liu Fuguo等[18]的方法，取一定量的共價(jià)復(fù)合物溶液，用圓二色光譜儀在室溫下測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，掃描范圍為遠(yuǎn)紫外區(qū)域190～260 nm，樣品池光程為0.1 nm，掃描速率為100 nm/min，分辨率為0.2 nm，頻帶寬度為2 nm，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過網(wǎng)站http∶//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk進(jìn)行在線分析。以β-Lg與CS物理混合物作為對(duì)照。

1.3.4 超高壓誘導(dǎo)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物的乳化性分析

1.3.4 .1 乳狀液的制備

取超高壓處理前后的樣品，溶解于50 mmol/L pH 4的醋酸緩沖液中，配制成β-Lg的質(zhì)量濃度為2 g/L的溶液，攪拌，溶脹過夜至完全溶解，形成水相。在高速剪切分散器的攪拌下緩慢將芥花籽油加入水相中（油相∶水相質(zhì)量比＝5∶95），以10 000 r/min剪切6 min，形成粗乳液。再將粗乳液通過高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)一步均質(zhì)得到β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物乳狀液。本實(shí)驗(yàn)采用二級(jí)加壓，一級(jí)均質(zhì)壓力為60 MPa，二級(jí)均質(zhì)壓力為6 MPa，均質(zhì)3 次，均質(zhì)溫度25 ℃，乳液制備后迅速測(cè)定粒徑。

1.3.4 .2 粒徑和Zeta-電位的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用粒度電位儀測(cè)定乳狀液粒徑和Zeta-電位，測(cè)定時(shí)樣品池溫度設(shè)定為25 ℃，測(cè)定角度為90°。為了減小多重光散射對(duì)測(cè)量結(jié)果造成的誤差，所有樣品在分析測(cè)試前稀釋500 倍。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，粒徑結(jié)果以數(shù)均粒徑平均值表示，以Zeta-電位表示顆粒表面電勢(shì)的大小。

1.3.4 .3 物理穩(wěn)定性分析

本實(shí)驗(yàn)利用Turbiscan AGS全能穩(wěn)定性分析儀測(cè)定乳狀液的物理穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中，取約20 mLβ-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物乳狀液裝入測(cè)量池中，使樣品量達(dá)到測(cè)量池架的高度（約43 mm），溫度設(shè)定為25 ℃，每隔30 min掃描一次，持續(xù)掃描4 h，最終得到樣品在參比模式下的穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)指數(shù)（turbiscan stability index，TSI）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析。采用單因素方差分析和Duncan's法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓誘導(dǎo)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物的褐變程度分析結(jié)果

據(jù)報(bào)道，294 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加表明無色化合物的形成，該化合物可能是美拉德反應(yīng)初級(jí)階段的反應(yīng)產(chǎn)物，是棕色產(chǎn)物——類黑素形成的前提；而420 nm波長(zhǎng)處的吸光度可以表示美拉德反應(yīng)棕色產(chǎn)物的吸收峰，代表了反應(yīng)的晚期階段，通常用于衡量美拉德反應(yīng)的程度[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)不斷增加，導(dǎo)致褐變程度增加，但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不溶于緩沖溶液的現(xiàn)象。所以，選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件（55 ℃、16 h），能夠保證美拉德反應(yīng)發(fā)生并且產(chǎn)物都溶于水。由圖1A可知，隨著CS比例的增加，初級(jí)產(chǎn)物含量均有不同程度的增加，其中m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4的共價(jià)復(fù)合物A294nm最高，達(dá)到1.69±0.05。由圖1B可知，共價(jià)復(fù)合物β-Lg-CS的A420nm約為物理混合物的2 倍，隨著CS比例的增加，A420nm也增加，且在m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)達(dá)到最大，為0.137±0.012，說明美拉德反應(yīng)的程度逐漸增大。

由圖1C、D可知，隨著壓力的增加，CS比例較低時(shí)（1∶1/1∶2），美拉德反應(yīng)的初級(jí)產(chǎn)物和最終階段的棕色產(chǎn)物的含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這可能是由于600 MPa高壓抑制了美拉德反應(yīng)中Amadori重排產(chǎn)物的降解，從而延緩了反應(yīng)的中間階段和晚期階段[20]。當(dāng)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)，隨著壓力的增加，初級(jí)產(chǎn)物和棕色產(chǎn)物的含量均出現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)。這與Ma Xiaojuan等[19]研究超高壓對(duì)賴氨酸/精氨酸-葡萄糖/果糖模型中美拉德反應(yīng)褐變影響的結(jié)果相似，一方面，可能是因?yàn)樘菨舛鹊脑黾佑欣诿览路磻?yīng)程度的加深，使得600 MPa高壓對(duì)其的抑制作用減弱；另一方面，也有報(bào)道稱，600 MPa的高壓使美拉德反應(yīng)增強(qiáng)[21]。

圖1 超高壓對(duì)不同質(zhì)量比的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物褐變程度的影響Fig.1 Effects of UHP treatments on browning degree of Maillard reaction products from β-Lg and CS with different ratios

2.2 超高壓誘導(dǎo)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.1β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物紫外-可見吸收光譜分析結(jié)果

紫外-可見光譜是分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的一種重要方法，在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)的吸收峰通常為芳香族氨基酸特征峰[22]，為了進(jìn)一步探討β-Lg與CS之間的相互作用及其共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化，實(shí)驗(yàn)對(duì)不同比例共價(jià)復(fù)合物以及不同壓力處理的共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行紫外-可見光譜表征。如圖2A所示，共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的主要吸收峰均出現(xiàn)在280 nm波長(zhǎng)處，該處的峰一般表示β-Lg中芳香族殘基，即酪氨酸和色氨酸的吸收峰[23]。β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物均比物理混合物峰值低，說明美拉德反應(yīng)對(duì)蛋白中的芳香族氨基酸殘基有一定屏蔽作用。

圖2 超高壓對(duì)不同質(zhì)量比的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物和物理混合物紫外-可見吸收光譜的影響Fig.2 Effects of UHP treatments on UV absorption spectra of β-Lg-CS complexes and mixtures with different ratios

圖2B～D為不同比例β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物在250～500 nm波長(zhǎng)處的吸收光譜。不同條件制備的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物均在281 nm波長(zhǎng)附近出現(xiàn)峰值，與常壓樣品相比，所有樣品均未出現(xiàn)較為明顯的紅移或藍(lán)移。m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶2時(shí)，隨著處理壓力的增加，吸收峰峰值先增大后減??；當(dāng)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)，隨壓力的增加，峰值增大；而m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1時(shí)，吸收峰峰值無明顯規(guī)律。說明壓力一定程度上改變了β-Lg與CS反應(yīng)形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

2.2.2β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物熒光光譜分析結(jié)果

熒光光譜測(cè)定用于表征β-Lg和CS美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在不同壓力作用下結(jié)構(gòu)的變化。由圖3A可知，β-Lg和CS的共價(jià)復(fù)合物熒光強(qiáng)度均比其物理混合物峰值要低，并且隨著CS比例的增加，共價(jià)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度峰值降低。熒光強(qiáng)度的降低可能是由于CS連接到蛋白分子上對(duì)色氨酸殘基產(chǎn)生一定的屏蔽作用，減少其與熒光猝滅物質(zhì)的反應(yīng)，說明共價(jià)復(fù)合改變了蛋白質(zhì)的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，從而改變了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[24]。

圖3 超高壓對(duì)不同質(zhì)量比的β-Lg-CS物理混合物和共價(jià)復(fù)合物熒光光譜的影響Fig.3 Effects of UHP treatments on fluorescence spectra of β-Lg-CS complexes with different ratios

由圖3B～D可知，m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1時(shí)，美拉德反應(yīng)后，產(chǎn)物熒光光譜的吸收峰峰值隨壓力的升高先增大后減小。楊萍等[25]研究高壓協(xié)同美拉德反應(yīng)對(duì)α-乳白蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，隨著壓力的增大，共價(jià)復(fù)合物的吸收峰強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱，吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)可能是因?yàn)楦邏簩?dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部非極性環(huán)境中的色氨酸殘基轉(zhuǎn)移到分子外部；吸收峰強(qiáng)度減弱可能是因?yàn)殡S著美拉德反應(yīng)程度增大，蛋白質(zhì)結(jié)合的CS增多，對(duì)色氨酸產(chǎn)生了更強(qiáng)的屏蔽效應(yīng)[25]。m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶2時(shí)，美拉德反應(yīng)后，產(chǎn)物的熒光光譜吸收峰峰值隨壓力的增大呈上升趨勢(shì)，說明色氨酸所處微環(huán)境的極性發(fā)生改變。m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)，美拉德反應(yīng)后，產(chǎn)物的熒光光譜吸收峰峰值隨壓力增大而降低，且均低于m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1、1∶2時(shí)吸收峰峰值。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)CS比例較高，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的屏蔽效應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響占主導(dǎo)地位。

2.2.3β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物圓二色光譜分析結(jié)果

圓二色光譜可以用來表征蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。不同方式β-Lg、CS混合后的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化如圖4A所示。復(fù)合物在208、218 nm波長(zhǎng)處分別有一個(gè)負(fù)峰，均對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)分子的α-螺旋結(jié)構(gòu)，一般通過β-Lg在208 nm波長(zhǎng)處峰的橢圓度來計(jì)算其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的含量[26]。當(dāng)發(fā)生美拉德反應(yīng)后，蛋白質(zhì)在208、218 nm波長(zhǎng)處的負(fù)峰強(qiáng)度均明顯減弱，但峰形基本保持不變。結(jié)合表中數(shù)據(jù)，說明超高壓處理顯著改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使m（β-Lg）∶m（CS）為1∶1、1∶2、1∶4的復(fù)合物α-螺旋相對(duì)含量分別由19.5%、21.1%、22.5%降至18.7%、16.9%、15.9%，分子結(jié)構(gòu)變得更加伸展；此外，無規(guī)卷曲相對(duì)含量分別由7.9%、10.2%、8.1%增加至16.6%、16.1%、17.6%，說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加不規(guī)則。隨著CS添加比例的增加，共價(jià)復(fù)合物的α-螺旋相對(duì)含量逐漸降低（18.7%、16.9%、15.9%），β-折疊相對(duì)含量逐漸升高（31.2%、34.0%、34.8%）。

圖4 超高壓對(duì)不同質(zhì)量比的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物的圓二色光譜影響Fig.4 Effects of UHP treatments on CD spectra of β-Lg-CS complexes with different ratios

經(jīng)不同壓力處理的不同β-Lg、CS質(zhì)量比的共價(jià)復(fù)合物其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化如圖4B～D所示。結(jié)果表明，當(dāng)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1、1∶2、1∶4時(shí)，隨壓力的增大，共價(jià)復(fù)合物α-螺旋相對(duì)含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均在400 MPa時(shí)達(dá)到最大值，分別為19.6%、19.0%、16.6%，與丁儉等[27]研究超高壓對(duì)大豆蛋白與可溶性多糖復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果相一致。據(jù)分析，超高壓處理會(huì)改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，相應(yīng)地改變蛋白質(zhì)整體構(gòu)象的柔韌性；蛋白質(zhì)內(nèi)部肽鏈結(jié)構(gòu)的改變和伸展會(huì)影響蛋白質(zhì)分子與多糖分子的鍵合作用，從而影響復(fù)合物的功能特性，壓力過高時(shí)反而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集無法伸展[28-29]。與m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1、1∶2相比，當(dāng)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)，加壓對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響相對(duì)較弱。這可能是由于美拉德反應(yīng)的增強(qiáng)使螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，而高壓條件會(huì)導(dǎo)致螺旋結(jié)構(gòu)含量增多，兩種作用相互抵消的結(jié)果。除此之外，有的研究也表明壓力處理后，β-Lg的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化[25]。

2.3 超高壓誘導(dǎo)β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物的乳化性分析結(jié)果

2.3.1 乳液粒徑、Zeta-電位分析結(jié)果

由圖5A可知，不同比例（m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1、1∶2、1∶4）共價(jià)復(fù)合物制備的乳液粒徑（399.1、481.5、584.4 nm）均比其物理混合物的粒徑（521.4、518.0、621.2 nm）要小。隨著CS比例的增加，粒徑呈增大趨勢(shì)。由圖5B可知，不同比例共價(jià)復(fù)合物制備的乳液Zeta-電位在46～48 mV，均顯著高于物理混合物制備的乳液Zeta-電位（31.2～43.1 mV）（P＜0.05），說明前者液滴間的排斥力更大，乳狀液更加穩(wěn)定。隨CS比例的增加，共價(jià)復(fù)合物制得乳狀液Zeta-電位幾乎保持不變，而物理混合物制得乳狀液所帶電荷呈大幅度上升趨勢(shì)。說明美拉德反應(yīng)的進(jìn)行有利于乳狀液的穩(wěn)定性。

由圖5C可知，當(dāng)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1和1∶2時(shí)，壓力的增大對(duì)乳液粒徑?jīng)]有顯著影響（P＞0.05）。在壓力相同時(shí)，隨著CS比例增加，粒徑也增加。由圖5D可知，m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1時(shí)，液滴Zeta-電位隨壓力的增大呈小幅下降趨勢(shì)。m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶2時(shí)，液滴Zeta-電位隨壓力的增大無顯著變化（P＞0.05）。m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)，液滴Zeta-電位隨壓力的增大先增加后減少，在200 MPa時(shí)達(dá)到最高，為（51.17±1.01）mV，這與Wang Yong等[30]的研究結(jié)果一致。說明不同的超高壓處理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)結(jié)合可溶性多糖分子的量不同，導(dǎo)致復(fù)合物表面所帶的電荷不同。這可能是由于不同超高壓處理對(duì)蛋白的柔性區(qū)域、構(gòu)象的影響不同，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白分子通過靜電作用結(jié)合大分子多糖的能力不同[31-32]。

圖5 超高壓對(duì)不同質(zhì)量比的β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的乳液粒徑和Zeta-電位的影響Fig.5 Effect of UHP on the particle size and zeta-potential of emulsions containing β-LG-CS complexes and physical mixtures at different ratios

2.3.2 乳液物理穩(wěn)定性分析結(jié)果

為了更好地比較不同乳狀液之間物理穩(wěn)定性的差異，采用乳狀液的TSI來表征其穩(wěn)定性。TSI是一個(gè)計(jì)算值，是由儀器測(cè)量所得的原始數(shù)據(jù)——BS（背散射光）和T（透射光）的信號(hào)幅度直接計(jì)算而得。其累計(jì)了樣品的所有變化，并給出唯一的數(shù)字結(jié)果，反映了給定樣品的不穩(wěn)定程度：TSI越高，表示樣品越不穩(wěn)定。由圖6A可知，在m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1、1∶2、1∶4時(shí)，共價(jià)復(fù)合物的TSI均低于相應(yīng)物理混合物的TSI，說明美拉德反應(yīng)對(duì)共價(jià)復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性具有積極影響。4 h后1∶1、1∶2、1∶4 3 種比例的物理混合物制得乳液的TSI分別為25.18、36.50、1.39，而對(duì)應(yīng)的共價(jià)復(fù)合物僅為1.60、2.31、0.49?？梢园l(fā)現(xiàn)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4的共價(jià)復(fù)合物制得的乳液TS值最低，說明其制備的乳液穩(wěn)定性最強(qiáng)。

圖6B顯示了測(cè)量4 h后不同比例和不同壓力的β-Lg-CS復(fù)合物的TSI。當(dāng)m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1時(shí)，隨處理壓力（200～400 MPa）的增大，乳液TSI逐漸升高（1.17、1.94、2.20），并最終高于對(duì)照組（1.60）。這可能是因?yàn)閴毫ι邔?dǎo)致乳液Zeta-電位下降（圖5D），進(jìn)而導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性降低。而在m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶2條件下，隨處理壓力（200～400 MPa）的增大，乳液TSI先升高后降低（0.82、0.85、0.62），均顯著低于未處理組（2.31），說明此時(shí)超高壓有利于提高共價(jià)復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性。在m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4條件下，超高壓處理組乳液TSI均高于對(duì)照組，說明超高壓不利于其穩(wěn)定性。此外，有研究報(bào)道，單一β-Lg制備的乳液TSI在4 h后為0.924 643[33]，從圖中可以發(fā)現(xiàn)只有m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶2（200、400、600 MPa）和1∶4（0.1、200、600 MPa）條件下的乳液穩(wěn)定性高于單一蛋白，再結(jié)合粒徑、Zeta-電位及褐變程度的分析，最終認(rèn)為m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4、壓力600 MPa的條件最有利于改善β-Lg-CS的乳化穩(wěn)定性。

圖6 不同壓力和質(zhì)量比下β-Lg-CS共價(jià)復(fù)合物及物理混合物的乳液Turbiscan掃描圖譜Fig.6 Effect of UHP on Turbiscan spectra of emulsions containing β-Lg-CS complexes and mixtures with different ratios

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)選用m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶1、1∶2和1∶4 3 種比例，對(duì)其進(jìn)行超高壓處理，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了美拉德反應(yīng)溫度（55 ℃）和時(shí)間（16 h），以確保共價(jià)復(fù)合物的水溶性。以單一蛋白β-Lg與CS物理混合物為對(duì)照，研究超高壓誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物制備過程的影響并分析產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、乳化性能。294 nm和420 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加說明美拉德反應(yīng)的發(fā)生，共價(jià)復(fù)合物的產(chǎn)生量隨CS比例的增加而增加。m（β-Lg）∶m（CS）＝1∶4時(shí)，超高壓有利于美拉德反應(yīng)程度的加深。熒光光譜和圓二色光譜結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)和超高壓均顯著改變了β-Lg的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。共價(jià)復(fù)合物的乳液粒徑和TSI均低于相應(yīng)物理混合物，Zeta-電位均高于相應(yīng)物理混合物，從這3 個(gè)角度充分證明美拉德反應(yīng)對(duì)乳化穩(wěn)定性的積極影響；此外，在特定條件下，超高壓可以通過減小乳液粒徑、增加表面電荷、降低TSI來改善蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性。