微波-快速凍融耦合魚皮明膠理化性質(zhì)分析

杜 杰，劉廷薇，馬 良，王洪霞，戴宏杰，余 永，朱翰昆，張宇昊

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

明膠是水溶性的熱可逆多功能天然高分子聚合物，由母體膠原蛋白部分水解得到。明膠具有可逆轉(zhuǎn)變的良好特性，被廣泛用于藥物控制釋放、生物組織工程、食品和化妝品行業(yè)[1]。明膠提取通常需要經(jīng)過兩個(gè)步驟——明膠化和熱提取[2]。明膠化過程破壞共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)鍵（主要是氫鍵），從而使膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)松散，產(chǎn)生充分的溶脹和膠原蛋白增溶作用[3]。熱處理會(huì)進(jìn)一步裂解氫鍵和共價(jià)鍵，破壞三螺旋的穩(wěn)定性，使螺旋結(jié)構(gòu)過渡到線圈結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為可溶性明膠，此轉(zhuǎn)化常通過45 ℃以上的水浴加熱來實(shí)現(xiàn)[4]。

酸堿法是我國(guó)明膠生產(chǎn)中采用的主要方法[5]，使用酸堿處理可以破壞膠原蛋白中的共價(jià)鍵和一些次級(jí)鍵，以便原料在熱水提膠過程中釋放出膠原蛋白的亞基成分，從而形成明膠。酸和堿工藝都需要消耗大量的淡水，同時(shí)排放大量的廢水污染物，嚴(yán)重危害環(huán)境[6]。同時(shí)，熱水提膠過程通常為傳統(tǒng)水浴提取，時(shí)間在數(shù)小時(shí)至數(shù)十小時(shí)不等，這是明膠生產(chǎn)周期長(zhǎng)的主要原因。

目前，誘導(dǎo)膠原明膠化的新方法以酶法為主。從20世紀(jì)90年代以來，已有采用酶法生產(chǎn)明膠的報(bào)道。酶法提取明膠主要利用胃蛋白酶[7]、胰蛋白酶[8]、木瓜蛋白酶[9]等破壞原料中雜蛋白和膠原蛋白的非螺旋區(qū)，使三螺旋結(jié)構(gòu)松散，從而使亞基組分在后期熱水提膠過程中可以被釋放。但該方法幾乎不能破壞維持膠原纖維穩(wěn)定的分子間共價(jià)鍵，因此提取的明膠得率較低[10-11]，且小分子成分含量高，明膠凝凍強(qiáng)度低，這使得酶法所制明膠的市場(chǎng)價(jià)值低且競(jìng)爭(zhēng)力差。本課題組曾嘗試超高壓法制備明膠，發(fā)現(xiàn)超高壓會(huì)破壞原料膠原中的氫鍵平衡，使膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)松散[12]。此外，本課題組還探索了快速凍融協(xié)同稀酸誘導(dǎo)膠原明膠化法[13]，發(fā)現(xiàn)該法可以有效打破氫鍵平衡，使膠原三螺旋結(jié)構(gòu)松散，從而顯著縮短豬皮膠原的明膠化時(shí)間。但這些方法因設(shè)備無法實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，或因未能完全脫離酸的使用而無法真正達(dá)到明膠綠色清潔制備的要求。

微波除了加熱作用外，對(duì)蛋白質(zhì)也有一定作用。Zhang Jinwei等[14]將微波應(yīng)用于清洗皮革時(shí)發(fā)現(xiàn)，微波會(huì)使膠原蛋白中的極性基團(tuán)以相同的電荷趨勢(shì)形成平行排列。Guan Junjun等[15]發(fā)現(xiàn)，微波首先可以破壞蛋白質(zhì)與巰基的二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞基的分解。Pi?tkowski等[16]發(fā)現(xiàn)在微波輻射下生物聚合物會(huì)發(fā)生降解。由此可知，微波可以打斷蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵，破壞蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)。凍融過程是冷凍和解凍融化的統(tǒng)稱，凍融循環(huán)會(huì)引起蛋白質(zhì)的變化，尤其是次級(jí)鍵的變化。而疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵和離子相互作用等次級(jí)鍵的形成會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，肌球蛋白頭部聚集[17]。

基于微波對(duì)蛋白質(zhì)共價(jià)鍵的破壞和凍融對(duì)蛋白質(zhì)次級(jí)鍵的影響，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地提出微波-快速凍融耦合明膠化的方式，即膠原原料經(jīng)微波預(yù)處理后進(jìn)行快速凍融，然后再采用微波輔助提取。整個(gè)制備過程沒有酸堿的使用，提取時(shí)間短，綠色清潔。本研究擬通過明膠等電點(diǎn)、透射比、分子質(zhì)量分布、凝凍強(qiáng)度測(cè)定以及流變學(xué)特性、氨基酸組成和傅里葉變換紅外光譜分析對(duì)微波-快速凍融耦合魚皮明膠進(jìn)行理化性質(zhì)表征，并與傳統(tǒng)的酸法制備明膠相比較，以期對(duì)此種新型明膠的基本性質(zhì)、凝膠性能和明膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚皮 山東省中魯遠(yuǎn)洋（煙臺(tái)）食品有限公司。

液氮 沙坪壩區(qū)雙流液氮經(jīng)營(yíng)部；鹽酸、十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS）、溴化鉀（光譜純） 成都市科龍?jiān)噭S；L-羥脯氨酸合肥博美生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MAS-II plus微波合成萃取反應(yīng)工作站 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；TA.XT2i物性測(cè)定儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)PerkinElmer公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀日本日立公司；DHR-1流變儀 美國(guó)TA公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 微波-快速凍融耦合魚皮明膠提取工藝及提取率的計(jì)算

魚皮→室溫解凍→去鱗去脂肪→剪碎脫脂、去雜蛋白→清洗→微波預(yù)處理→快速凍融→微波輔助提取→過濾、烘干→成品明膠

去鱗去脂肪：魚皮解凍后，刮去表面鱗片、脂肪和多余的肉，清洗干凈。剪碎脫脂、去雜蛋白：魚皮剪成4 mm×4 mm片狀，加入SDBS溶液（0.75 g/100 mL），超聲脫脂2 h，每1 h更換一次脫脂液，超聲功率120 W、溫度25 ℃。將脫脂后清洗瀝干的魚皮按照料液比1∶5加入NaCl溶液（1.0 g/100 mL），磁力攪拌6 h，每2 h更換一次NaCl溶液。微波預(yù)處理：魚皮與去離子水按料液比1∶6混合，55 ℃、350 W條件下微波預(yù)處理15 min。快速凍融：將魚皮濾出，濾液備用，用液氮快速冷凍魚皮，之后放入濾液中，在30 ℃水浴條件下攪拌解凍。微波輔助提?。簩Ⅳ~皮與濾液混合物轉(zhuǎn)移至微波提取容器中，按體積比50∶1加入質(zhì)量濃度為6 g/100 mL的硅藻土溶液，55 ℃、350 W條件下微波加熱提取60 min。過濾、烘干：微波提取后，濾去魚皮，提取液經(jīng)中速濾紙抽濾后，在60 ℃熱風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干。明膠提取率按照下式計(jì)算。

1.3.2 傳統(tǒng)酸法魚皮明膠提取工藝

魚皮→室溫解凍→去鱗去脂肪→剪碎脫脂、去雜蛋白→清洗→堿處理→水洗→酸處理、水洗→水浴提取→過濾、烘干→成品明膠

按1.3.1節(jié)方法對(duì)魚皮進(jìn)行前處理。堿處理：用NaOH溶液（0.8 g/100 mL）處理魚皮1 h，料液比1∶6，堿處理完成后使用流動(dòng)水沖洗魚皮至中性。酸處理、水洗：按1∶6料液比，用體積分?jǐn)?shù)2.2%的乙酸溶液處理魚皮2 h后，流動(dòng)水沖洗至pH 4.5左右。水浴提?。?5 ℃下水浴搖床中提取6 h，料液比1∶6。按1.3.1節(jié)方法對(duì)提取液進(jìn)行過濾烘干。

1.3.3 等電點(diǎn)測(cè)定

將明膠配制成pH 3～12質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的溶液，用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液透光率。明膠的等電點(diǎn)可以用溶液透光率最低時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值表示。

1.3.4 透射比測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的明膠溶液，在450 nm和620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定透射比。

1.3.5 明膠樣品的分子質(zhì)量分布測(cè)定

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）觀察明膠樣品的分子質(zhì)量分布。在60 ℃水浴條件下，將干明膠溶解到蒸餾水中，使最終明膠溶液質(zhì)量濃度為2 mg/mL。按照樣品和上樣緩沖液體積比3∶1添加還原性上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，立即冷卻上樣，上樣量為15 μL，Marker上樣量10 μL。電泳分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%和5%，初始電流設(shè)置為15 mA，當(dāng)藍(lán)色指示條帶遷移至分離膠時(shí)將電流調(diào)至25 mA，待指示條帶遷移凝膠底部即停止電泳。流動(dòng)水下取出電泳凝膠，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h后脫色至條帶清晰，在凝膠成像儀中觀察明膠分子質(zhì)量分布并拍照記錄。

1.3.6 凝凍強(qiáng)度測(cè)定

參考Chen Liqing等[18]的方法測(cè)定樣品凝凍強(qiáng)度。在60 ℃水浴條件下，將干明膠溶解在蒸餾水中，使溶液最終質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL。將明膠溶液轉(zhuǎn)移至一次性膠凍杯中，于4 ℃條件下冷藏16～18 h后即可進(jìn)行測(cè)量。選用探頭TA 10，設(shè)置下壓位移4 mm、測(cè)試速率1 mm/s，讀數(shù)即為明膠的凝凍強(qiáng)度，單位為Bloom g。

1.3.7 流變學(xué)特性分析

1.3.7 .1 溫度掃描

使用DHR-1流變儀對(duì)質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的明膠溶液進(jìn)行溫度掃描測(cè)試。夾具為40 mm的平板，間隙1 000 μm。設(shè)置溫度范圍5～40 ℃、溫度變化速率1 ℃/min、頻率1 Hz、應(yīng)變5%，首先進(jìn)行降溫過程，然后進(jìn)行升溫過程。膠凝/融化溫度用降溫過程或升溫過程中儲(chǔ)能模量G’和損耗模量G”的交叉點(diǎn)溫度表示。

1.3.7 .2 剪切黏度掃描

配制質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的明膠溶液，用DHR-1流變儀進(jìn)行剪切黏度掃描，設(shè)置溫度40 ℃、剪切速率變化范圍0～100 s－1。

1.3.8 氨基酸組成測(cè)定

稱取明膠粉末20 mg置于水解管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的鹽酸溶液，振蕩混勻，抽真空密封，放入熱風(fēng)干燥箱內(nèi)，110 ℃下沙浴水解24 h。水解完成后取出，冷卻至室溫，過濾到250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取1 mL水解液，氮吹至溶劑完全蒸發(fā)，再加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液，振蕩混勻后，過0.22 μm的濾膜，送入全自動(dòng)氨基酸分析儀中測(cè)定各氨基酸含量。其中羥脯氨酸含量參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜分析

將明膠粉末和溴化鉀粉末按照質(zhì)量比1∶400在瑪瑙研缽中充分研磨，至混合粉末無顆粒感，于40 ℃熱風(fēng)干燥箱中烘干12 h后壓成薄片，使用Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)以4 cm－1的分辨率掃描32 次[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過Duncan檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著性（P＜0.05），并使用Origin 9.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚皮明膠的提取率

微波-快速凍融耦合提取法和傳統(tǒng)酸法提取的魚皮明膠提取率分別為13.68%和22.01%，本課題組以往的工作中針對(duì)相同原料采取傳統(tǒng)酸法得到的魚皮明膠提取率為22.15%[20]。微波-快速凍融耦合提取魚皮明膠時(shí)，微波處理以及液氮凍融對(duì)魚皮中共價(jià)鍵的破壞力不如酸堿處理的破壞力強(qiáng)，提取過程中酸、堿液處理時(shí)間也遠(yuǎn)比微波處理和液氮凍融時(shí)間長(zhǎng)，這可能是造成微波-快速凍融耦合提取法提取率較低的原因。與傳統(tǒng)酸法相比，微波-快速凍融耦合提取方法提取率較低，但不會(huì)產(chǎn)生大量廢水，提取效率更高，在綠色提取方向有較好的應(yīng)用前景。

2.2 魚皮明膠的等電點(diǎn)

魚皮明膠的等電點(diǎn)如圖1所示。蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，當(dāng)正負(fù)電荷數(shù)相等即凈電荷為零時(shí)溶液的pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。當(dāng)溶液pH值處于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用最弱，溶解度最低，所以明膠的等電點(diǎn)可以用溶液透光率最低時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值表示。通常，根據(jù)明膠化方式的不同，明膠分為A型明膠和B型明膠兩種，A型明膠由酸法預(yù)處理后熱提取得到，等電點(diǎn)為pH 6～9；B型明膠由堿法預(yù)處理后熱提取得到，等電點(diǎn)為pH 5左右[21]。不同于A型和B型明膠，微波-快速凍融魚皮明膠等電點(diǎn)為7.0。預(yù)處理方式的不同導(dǎo)致明膠等電點(diǎn)存在差異的原因可能是，堿處理可使谷氨酰胺脫氨為谷氨酸，天冬酰胺脫氨為天冬氨酸[22]，使明膠等電點(diǎn)降低，而酸處理因保留了酰胺而使明膠帶更多的正電荷?，F(xiàn)有研究表明，在微波場(chǎng)作用下，微波的極化效應(yīng)使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵發(fā)生松弛、斷裂或重組[23]，這可能與微波-快速凍融耦合魚皮明膠的等電點(diǎn)低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠有關(guān)。

圖1 傳統(tǒng)酸法（A）和微波-快速凍融耦合（B）魚皮明膠的等電點(diǎn)Fig.1 Isoelectric points of gelatins prepared by the traditional acid method (A) and the sequential microwave and rapid freezing-thawing method (B)

2.3 魚皮明膠的透射比

魚皮明膠透射比如表1所示。透射比越大，樣品的透明度越高。GB 6783—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 明膠》中規(guī)定，明膠的透射比應(yīng)滿足在450 nm波長(zhǎng)處不低于30%；在620 nm波長(zhǎng)處不低于50%。由表1可知，微波-快速凍融耦合提取的明膠滿足GB 6783—2013要求。同時(shí)，無論是450 nm波長(zhǎng)處還是620 nm波長(zhǎng)處均顯示微波-快速凍融耦合魚皮明膠比傳統(tǒng)酸法魚皮明膠的透明度更低。兩種明膠化方式出現(xiàn)透明度差異的原因可能是，使用傳統(tǒng)酸法進(jìn)行明膠化時(shí)魚皮先經(jīng)過堿處理后再進(jìn)行酸處理，使膠原原料中影響明膠品質(zhì)的有機(jī)物雜質(zhì)溶出，在后續(xù)的水洗過程中隨流動(dòng)水除去[24]，而微波-快速凍融耦合明膠化不使用酸和堿，也不經(jīng)過水洗，明膠中可溶性雜質(zhì)難以除去。為了解決這個(gè)問題，本實(shí)驗(yàn)中，采用多次多級(jí)過濾的方式，去除明膠中影響品質(zhì)的可溶性有機(jī)物。即在微波-快速凍融耦合處理過程中，熱提取后的明膠溶液先用中速濾紙過濾，再依次過0.45 μm和0.22 μm的濾膜，使透明度得到很大程度的提高，但仍低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。

表1 魚皮明膠透射比Table 1 Transmittance of fish skin gelatins

2.4 魚皮明膠的分子質(zhì)量分布

魚皮明膠的分子質(zhì)量分布如圖2所示。明膠中高分子亞基主要是指分子質(zhì)量超過100 kDa的組分，主要是γ、β、α亞基，其中γ組分為α亞基的三聚體，β組分為α亞基的二聚體，高分子亞基的存在是影響明膠凝膠強(qiáng)度的主要因素之一，高凝膠強(qiáng)度的明膠往往具有更多的高分子亞基。SDS-PAGE圖清晰地展示出了兩種明膠化方式亞基組成的差異。微波-快速凍融耦合魚皮明膠的高分子亞基組分明顯少于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠，這可能會(huì)導(dǎo)致前者凝膠特性更低。

圖2 魚皮明膠的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of fish skin gelatins

2.5 魚皮明膠的凝凍強(qiáng)度

GB 6783—2013中規(guī)定，明膠的凝凍強(qiáng)度應(yīng)不低于50 Bloom g。由圖3可知，本研究所提取的明膠（傳統(tǒng)酸法魚皮明膠凝凍強(qiáng)度620.54 Bloom g、微波-快速凍融耦合魚皮明膠凝凍強(qiáng)度524.40 Bloom g）均達(dá)到GB 6783—2013要求。傳統(tǒng)酸法魚皮明膠凝凍強(qiáng)度顯著高于微波-快速凍融耦合魚皮明膠（P＜0.05）。

圖3 魚皮明膠的凝凍強(qiáng)度Fig.3 Gel strength of fish skin gelatins

明膠中高分子亞基和亞氨基酸含量是影響凝凍強(qiáng)度的兩個(gè)主要因素。從2.4節(jié)明膠分子質(zhì)量分布結(jié)果可知，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠化的明膠中α、β、γ等高分子亞基組分更多，而微波-快速凍融耦合明膠化的明膠在提取過程中更容易降解，高分子亞基含量少，小分子組分含量高。這是微波-快速凍融耦合魚皮明膠凝凍強(qiáng)度低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠的重要原因。

2.6 魚皮明膠的流變學(xué)特性分析結(jié)果

2.6.1 溫度掃描分析結(jié)果

評(píng)價(jià)溫度對(duì)明膠黏彈性影響的指標(biāo)包括G’、G”以及tanδ。G’為儲(chǔ)能模量，其越大，樣品體系內(nèi)儲(chǔ)存的能量越高，樣品彈性越大；G”為損耗模量，其越大，樣品由內(nèi)部摩擦而損耗的能量越高，體系黏性越大[25]；損耗角正切tanδ＝G”/G’，是衡量體系黏彈性的指標(biāo)，反映了高聚物的內(nèi)耗性，tanδ越大意味著分子鏈段運(yùn)動(dòng)越難，內(nèi)耗越多，體系偏向黏性；tanδ越小說明體系偏向彈性，固性增強(qiáng)。當(dāng)tanδ＞1時(shí)，體系中黏性占主導(dǎo)；當(dāng)tanδ＜1時(shí)，體系中彈性占主導(dǎo)[26]；當(dāng)tanδ＝1時(shí)G”＝G’，所對(duì)應(yīng)的溫度即為膠凝/融化溫度，通常情況下，明膠的融化溫度高于膠凝溫度，這個(gè)現(xiàn)象是凝膠融化時(shí)吸收能量而導(dǎo)致的[27]。

由圖4、5可知，初始降溫過程中，所有明膠tanδ均大于1，G”＞G’，表明降溫的初始狀態(tài)為黏性占主導(dǎo)的明膠溶液。當(dāng)下降到一定溫度時(shí)，G’和G”迅速上升，tanδ快速下降，說明此時(shí)體系彈性增加，固性增強(qiáng)，值得注意的是，G’開始迅速上升的溫度低于G”，當(dāng)溫度降低到G’開始快速上升的溫度時(shí)，tanδ到達(dá)最高值，溫度繼續(xù)下降到低于膠凝溫度后，tanδ＜1并繼續(xù)減小，整個(gè)體系轉(zhuǎn)化為以彈性為主的凝膠體系。升溫過程中，所有明膠初始tanδ均小于1，接近0，G”＜G’，表明升溫的初始狀態(tài)為彈性占主導(dǎo)的彈性凝膠體系。當(dāng)上升到一定溫度時(shí)，G’和G”迅速下降，tanδ快速上升，說明此時(shí)體系黏性增加，流動(dòng)性增強(qiáng)。當(dāng)溫度升高超過凝膠熔化溫度后，tanδ＞1并繼續(xù)增大，整個(gè)體系已經(jīng)轉(zhuǎn)化為黏性為主的溶液體系。同樣地，由于G”趨于穩(wěn)定時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度高于G’趨于穩(wěn)定時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度，所以當(dāng)G’剛開始穩(wěn)定時(shí)，tanδ達(dá)到峰值，溫度繼續(xù)上升，tanδ逐漸下降，待溫度上升至G”穩(wěn)定后，tanδ也趨于平穩(wěn)，最終均大于1，說明體系最終以黏性為主。

圖4 魚皮明膠的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G”）Fig.4 Elastic modulus (G’) and loss modulus (G”) of fish skin gelatins

圖5 魚皮明膠的損耗角正切（tan δ）Fig.5 Loss tangent (tan δ) of fish skin gelatins

在溫度掃描過程中，微波-快速凍融耦合魚皮明膠的儲(chǔ)能模量G’和損耗模量G”均低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。由圖6可知，溫度降低時(shí)，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠、微波-快速凍融耦合魚皮明膠由溶液體系轉(zhuǎn)化為凝膠體系（tanδ＝1）的溫度依次為18.44 ℃和10.30 ℃；溫度升高時(shí)，明膠由凝膠體系轉(zhuǎn)化為溶液體系的溫度（tanδ＝1）分別為20.64 ℃（微波-快速凍融耦合魚皮明膠）和25.56 ℃（傳統(tǒng)酸法魚皮明膠）。上述結(jié)果表明傳統(tǒng)酸法魚皮明膠體系中儲(chǔ)存的能量更大，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)固，類三螺旋含量更高[28]，微波-快速凍融耦合法明膠更易融化。在此基礎(chǔ)上，本研究做了進(jìn)一步的溶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，微波-快速凍融耦合明膠化所制明膠在冷水中輕輕搖晃約10 min即可溶解，對(duì)于明膠應(yīng)用的拓展具有一定的意義。市場(chǎng)上，明膠為粉末狀時(shí)被稱為吉利丁粉，為片狀時(shí)又被稱為吉利丁片，常用于制作慕斯、果凍和奶酪等各種需在低溫下保存的甜點(diǎn)。在使用吉利丁粉或吉利丁片時(shí)需先用冷水浸泡后加熱才能將其融化[29]，而微波-快速凍融耦合明膠化制備的明膠省略了加熱的步驟，可直接在冷水中溶解后混入慕斯?jié){，與打發(fā)的奶油混合均勻后即可冷藏，為甜品制作提供了方便。

圖6 魚皮明膠的膠凝/融化溫度Fig.6 Gelling and melting temperatures of fish skin gelatins

2.6.2 剪切黏度掃描分析結(jié)果

魚皮明膠的剪切黏度掃描分析結(jié)果如圖7所示。在剪切速率從0 s－1增大到100 s－1的過程中，原本在溶液中相互纏結(jié)碰撞的明膠分子隨著剪切應(yīng)力的增加而發(fā)生解纏，黏度下降，直至解纏速率等于纏結(jié)速率時(shí)，明膠溶液的黏度不再發(fā)生變化，表現(xiàn)為假塑性流體。微波-快速凍融耦合魚皮明膠黏度低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。通常流體中高分子成分越多，越容易在流動(dòng)時(shí)產(chǎn)生分子鏈間的纏結(jié)，從宏觀上看表現(xiàn)為黏度上升。這說明微波-快速凍融耦合魚皮明膠溶液中分子鏈更短，鏈間的纏結(jié)更少，因而黏度更低，流動(dòng)性更好。

圖7 魚皮明膠的剪切黏度掃描Fig.7 Viscosity versus shear rate curves of fish skin gelatins

2.7 魚皮明膠的氨基酸組成分析結(jié)果

魚皮明膠的氨基酸組成分布如表2所示。膠原蛋白中重復(fù)著Gly-X-Y序列[30]，其中X和Y位置分別被脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp）占據(jù)，由膠原部分水解得到的明膠也保持著這樣的氨基酸組成和排列方式。在膠原蛋白的氨基酸組成中，甘氨酸（Gly）含量最高，約占全部氨基酸殘基含量的1/3，由表2可知，Gly是兩種明膠中含量最高的氨基酸，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠、微波-快速凍融耦合魚皮明膠的甘氨酸含量分別為238、241 g/kg，彼此間相差不明顯。Pro和Hyp又稱為亞氨基酸，富含Pro和Hyp的區(qū)域可能參與成核區(qū)的形成，亞氨基酸的吡咯環(huán)對(duì)三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用，在宏觀上表現(xiàn)為影響明膠的凝膠強(qiáng)度等凝膠性能。由表2可知，兩種明膠的亞氨基酸含量?jī)H次于甘氨酸，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠和微波-快速凍融耦合魚皮明膠的亞氨基酸含量分別為194、182 g/kg，兩種明膠其余的氨基酸含量同樣沒有太大差別?？梢钥闯觯瑑煞N明膠制備方式均不會(huì)影響亞氨基酸所占比例，也不會(huì)因此而影響明膠性質(zhì)。綜上，因提取方法不同而產(chǎn)生的明膠性質(zhì)差異與氨基酸組成基本無關(guān)。

表2 魚皮明膠氨基酸組成Table 2 Amino acid compositions of fish skin gelatins

2.8 魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜結(jié)果如圖8所示。其特征譜帶信息如表3所示。酰胺A帶代表N—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)，當(dāng)其向低波數(shù)移動(dòng)時(shí)，表明N—H基團(tuán)參與的氫鍵含量增加[31]。由表3可知，微波-快速凍融魚皮明膠中，酰胺A帶波數(shù)為3 444.79 cm－1，低于傳統(tǒng)酸法明膠（3 466.37 cm－1）。這表明微波-快速凍融明膠中N—H參與形成的氫鍵含量更高，而傳統(tǒng)酸法魚皮明膠使明膠分子內(nèi)部氫鍵破壞更為嚴(yán)重。通常使用酰胺III帶的吸收峰強(qiáng)度與1 454 cm－1波數(shù)處的吸收峰強(qiáng)度的比值（AamideIII/A1454cm－1）衡量膠原蛋白三螺旋的完整性。由于明膠是膠原蛋白的部分水解產(chǎn)物，故其AamideIII/A1454cm－1都要小于1，AamideIII/A1454cm－1越接近1，表明三螺旋結(jié)構(gòu)保留越完整[32]，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠AamideIII/A1454cm－1為0.75，微波-快速凍融耦合魚皮明膠AamideIII/A1454cm－1為0.72，說明兩種明膠三螺旋結(jié)構(gòu)都相對(duì)完整，但微波-快速凍融耦合魚皮明膠的三螺旋結(jié)構(gòu)保留更少，與2.6.1節(jié)中水溶性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相印證。

表3 魚皮明膠傅里葉變換紅外光譜圖的特征譜帶信息Table 3 FTIR spectra major band information of fish skin gelatins

圖8 魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.8 FTIR spectra of fish skin gelatins

結(jié)合2.5節(jié)凝凍強(qiáng)度和2.6.1節(jié)溫度掃描結(jié)果來看，盡管微波-快速凍融耦合魚皮明膠的氫鍵較多，但其高分子亞基的含量明顯低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠，因此，微波-快速凍融耦合魚皮明膠的凝凍強(qiáng)度和G’、G”均較低。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，微波-快速凍融耦合魚皮明膠等電點(diǎn)為7，凝凍強(qiáng)度為524.40 Bloom g，透明度較好，以上指標(biāo)均符合GB 6783—2013要求。微波-快速凍融耦合魚皮明膠的模量（儲(chǔ)能模量G’和損耗模量G”）、膠凝/融化溫度和黏度均低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。微波-快速凍融耦合魚皮明膠比傳統(tǒng)酸法魚皮明膠中氫鍵含量更高，但由于高分子亞基含量低，故凝膠性能低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。微波-快速凍融耦合魚皮明膠與傳統(tǒng)酸法魚皮明膠氨基酸組成相似，說明兩種明膠制備方式不影響明膠的氨基酸組成。微波-快速凍融耦合提取魚皮明膠的方式不涉及到大量酸、堿的使用，對(duì)環(huán)境綠色友好，且得到的明膠具有較好的性質(zhì)，其較低的膠凝/融化溫度可實(shí)現(xiàn)冷水?dāng)嚢枞诨?，省略了加熱步驟，為實(shí)際生產(chǎn)提供了方便。