大白菜ABCB/PGP基因家族的鑒定與分析

于曉麗　陳超妍　吳雪寧　時(shí)云龍　劉超　劉振寧

摘 要 ABCB/PGP蛋白為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞家族，能夠參與植物中生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。為深入認(rèn)識(shí)大白菜ABCB/PGP基因家族，利用生物信息學(xué)方法對(duì)大白菜中ABCB/PGP基因家族成員進(jìn)行了全基因組水平鑒定，并對(duì)其基因組信息、蛋白質(zhì)生理生化特征、基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化等方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，大白菜基因組中共鑒定到31個(gè)ABCB/PGP基因，這些基因在大白菜的10條染色體上分布不均，其中第3、4、6、7和9號(hào)染色體上分布有較多的家族成員。外顯子-內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)分析表明，大部分ABCB/PGP基因都具有4～13個(gè)外顯子。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，ABCB/PGP蛋白多數(shù)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，大白菜ABCB/PGP基因被聚類成6個(gè)分支，分別為CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ、CladeⅣ、CladeⅤ和CladeⅥ。上述研究結(jié)果為大白菜ABCB/PGP基因功能的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 大白菜;ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;基因家族;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.06.001

植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又稱ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters），其廣泛存在于真核生物和原核生物中，是目前已知功能多樣、種類繁多的蛋白家族[1]。其中ABCB蛋白為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞家族，又稱為多藥物抗性蛋白（Multidrug Resistance，MDR）或p-糖蛋白（p-glycoprotein，PGP）。在植物中研究發(fā)現(xiàn)，ABCB/PGP蛋白家族主要參與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸[2]。另有研究表明，ABCB/PGP蛋白參與了植物細(xì)胞的木質(zhì)化進(jìn)程以及鐵的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[3-4]。目前，研究人員已經(jīng)對(duì)擬南芥、水稻、玉米、高粱、楊樹、桃、卷柏和小立碗蘚等植物中的ABCB/PGP基因家族進(jìn)行了全基因組水平上的鑒定與分析。大白菜是我國(guó)的特色蔬菜之一，栽培面積和消費(fèi)量在我國(guó)各類蔬菜中排行前列。大白菜全基因組測(cè)序的完成使得對(duì)大白菜相關(guān)基因家族的鑒定與分析成為可能。

本研究利用擬南芥ABCB/PGP氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組中進(jìn)行搜索比對(duì)，鑒定出大白菜中ABCB/PGP基因家族成員，并結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析ABCB/PGP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分類，以期為進(jìn)一步研究大白菜ABCB/PGP基因的生物學(xué)功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大白菜ABCB/PGP基因家族的鑒定

以擬南芥ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//brassicadb.org/brad/）中通過(guò)BLAST P進(jìn)行第一次比對(duì)搜索，找出候選基因。為了防止候選基因存在遺漏，再在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了二次BLAST P比對(duì)搜索，保證最后數(shù)據(jù)的完整性。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、SMART數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的有無(wú)鑒定是否屬于該基因家族。

1.2 大白菜ABCB/PGP基因的基因組信息和染色體定位

通過(guò)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得大白菜ABCB/PGP基因的序列和基因組信息，并根據(jù)每一個(gè)ABCB/PGP基因在染色體上的精確位置和染色體的長(zhǎng)度使用Photoshop軟件將ABCB/PGP基因人工定位到對(duì)應(yīng)的染色體上。大白菜ABCB/PGP蛋白的分子量和等電點(diǎn)通過(guò)進(jìn)行在線分析。

1.3 大白菜ABCB/PGP基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進(jìn)化樹分析

ABCB/PGP基因的外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)圖使用GSDS在線軟件繪制。關(guān)于進(jìn)化樹的構(gòu)建，使用MEGA 5.0軟件自帶的Clustal W應(yīng)用對(duì)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴(kuò)展罰分設(shè)置為0.2。然后將比對(duì)好的序列利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化樹使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正，成對(duì)刪除和1 000次重復(fù)等建樹參數(shù)然后將比對(duì)好的序列構(gòu)成進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜ABCB/PGP基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列，在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索比對(duì)，在大白菜中鑒定到31個(gè)ABCB/PGP蛋白，同時(shí)參考擬南芥ABCB/PGP基因命名的方法對(duì)大白菜ABCB/PGP基因進(jìn)行了命名，見(jiàn)表1。31個(gè)ABCB/PGP基因的開放閱讀框長(zhǎng)度在442～4 249 bp，

編碼147～1 416個(gè)氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量在24.6～332.1 kDa，等電點(diǎn)在4.76～9.48。大部分ABCB/PGP基因都定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。對(duì)大白菜ABCB/PGP基因染色體定位的分析表明，ABCB/PGP基因在大白菜的10條染色體上分布不是很均勻，其中第3、4、6、7和9號(hào)染色體上較多，而第1、2、5、8和10號(hào)染色體上的ABCB/PGP基因則比較少，僅有一兩個(gè)分布其上，如圖1所示。

2.2 大白菜ABCB/PGP基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

為分析大白菜ABCB/PGP基因的系統(tǒng)發(fā)育和分類，選取了大白菜、擬南芥這兩個(gè)代表性物種中ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建了NJ進(jìn)化樹并對(duì)ABCB/PGP基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，這2個(gè)物種中的52個(gè)ABCB/PGP基因被聚類成6個(gè)分支，分支為CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ、CladeⅣ、CladeⅤ和CladeⅥ。從進(jìn)化樹中可以看出每個(gè)分支都含有擬南芥ABCB/PGP基因與大白菜ABCB/PGP基因，分布比較均勻。其中CladeⅠ分支是基因分布最多的，在CladeⅠ分支中含有9個(gè)大白菜ABCB/PGP基因，分別為BrABCB1～BrABCB9，而擬南芥ABCB/PGP基因含有8個(gè)，分別為AtPGP3、AtPGP4、AtPGP5、AtPGP7、AtPGP9、AtPGP11、AtPGP12、AtPGP21;分支CladeⅤ是分布最少的，其中大白菜ABCB/PGP基因含有2個(gè)，為BrABCB25和BrABCB26，擬南芥ABCB/PGP基因也含有2個(gè)，分別為AtPGP13和AtPGP14。其他的CladeⅡ分支含有大白菜ABCB/PGP基因9個(gè)，含有擬南芥ABCB/PGP基因4個(gè);CladeⅢ分支含有大白菜ABCB/PGP基因3個(gè)，而含有擬南芥ABCB/PGP基因2個(gè);CladeⅣ分支中含有大白菜ABCB/PGP基因4個(gè)，擬南芥ABCB/PGP基因2個(gè);CladeⅥ分支含有大白菜ABCB/PGP基因5個(gè)，擬南芥ABCB/PGP基因也是2個(gè)。

為進(jìn)一步研究大白菜ABCB/PGP基因在植物中的進(jìn)化模式，選用了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹、小立碗蘚、卷柏和桃這8個(gè)代表性物種中的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0軟件構(gòu)建了進(jìn)化樹并對(duì)各物種中ABCB/PGP基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，這8個(gè)物種的ABCB/PGP基因被聚類成7個(gè)分支，多了一個(gè)分支CladeⅦ。其中CladeⅠ～Ⅵ每個(gè)分支都有分布各個(gè)物種的基因，而CladeⅦ分支上沒(méi)有大白菜和擬南芥的基因分布。

2.3 大白菜ABCB/PGP基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究大白菜ABCB/PGP基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)大白菜基因組信息獲取了每一個(gè)ABCB/PGP基因的DNA和CDS序列信息并構(gòu)建了其基因結(jié)構(gòu)圖（圖4），結(jié)果表明大部分ABCB/PGP基因都有4～13個(gè)不等的外顯子且各分支分布相對(duì)比較均勻，只有其中部分小分支如BrABCB24、BrABCB31分布較少只有1～2個(gè)。同時(shí)，大部分ABCB/PGP基因都含有3～12個(gè)不等的內(nèi)含子，其中BrABCB24有1個(gè)內(nèi)含子，而BrABCB31則沒(méi)有內(nèi)含子。

3 討論與結(jié)論

本研究在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到了31個(gè)ABCB/PGP基因家族成員，該家族是一個(gè)成員數(shù)目相對(duì)較多的家族。Gao等通過(guò)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)的3個(gè)蛋白家族成員（AUX/LAX、PIN和ABCB/MDR/PGP）進(jìn)行了鑒定，其中篩選到27個(gè)ABCB/PGP基因家族成員，比本研究中鑒定到的基因家族成員少4個(gè)，分別為Bra025328、Bra039056、Bra027825和Bra033064[5]。但是需要注意的是，Bra027825和Bra033064這兩個(gè)基因的開放閱讀框長(zhǎng)度跟其他ABCB/PGP基因家族成員相比較小，筆者推測(cè)這兩個(gè)基因可能是假基因或者沒(méi)有拼接出全長(zhǎng)序列。

本研究首先選取了大白菜和擬南芥2個(gè)物種的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，52個(gè)ABCB/PGP基因被聚類成6個(gè)分支，即CladeⅠ～CladeⅥ，然后進(jìn)一步選取了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹、小立碗蘚、卷柏和桃8個(gè)代表性物種中的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)這8個(gè)物種的ABCB/PGP基因被聚類成7個(gè)分支，多了一個(gè)分支CladeⅦ，而CladeⅦ分支上均沒(méi)有大白菜和擬南芥的基因分布。大白菜ABCB/PGP基因在CladeⅦ的缺失原因仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱璐，許杰，張大兵.擬南芥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)類蛋白家族的分子進(jìn)化、表達(dá)模式和蛋白功能網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析[J].植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（12）：1151-1166.

[2] GEISLER M，BLAKESLEE JJ，BOUCHARD R，et al.

Cellular efflux of auxin catalyzed by the Arabidopsis MDR/PGP transporter AtPGP1[J].Plant Journal，2005，44（02）：179-194.

[3] KANEDA M，SCHUETA M，LIN BS，et al. ABC transporters coordinately expressed during lignification of Arabidopsis stems include a set of ABCBs associated with auxin transport[J].Journal of Experimental Botany，2011，62（06）：2063-2077.

[4] XU YX，ZHANG SN，GUO HP，et al. OsABCB14 functions in auxin transport and iron homeostasis in rice （Oryza sativa L.）[J].Plant Journal，2014，79（01）：106-117.

[5] GAO LW，LYU SW，TANG J，et al.Genome-wide analysis of auxin transport genes identifies the hormone responsive patterns associated with leafy head formation in Chinese cabbage[J].Scientific Reports，2017，7：42229.

（責(zé)任編輯：趙中正）