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    PTEN基因mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)及其對卵巢癌的診斷價值

    2021-06-30 03:26:08陳建歐鄭旭旭
    中國婦幼健康研究 2021年6期
    關(guān)鍵詞:基因突變卵巢癌分化

    方 燕,陳建歐,鄭旭旭

    (溫州市中醫(yī)院病理科,浙江 溫州 325000)

    卵巢癌是女性發(fā)生率較高的生殖器官惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于宮頸癌及子宮體癌[1]。目前,臨床上對于卵巢癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明,普遍認(rèn)為與遺傳因素、內(nèi)分泌因素等有關(guān),臨床表現(xiàn)多以疼痛為主,部分患者可伴有下腹包塊、月經(jīng)不調(diào)等[2]。PTEN基因是除p53基因外的第二大抑癌基因,主要定位于在10號染色體上,具有雙重特異性[3]。研究表明,PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性拮抗磷脂酰肌醇-3-激酶(PIEK)/AKT/mTOR途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活[4]。故PTEN的突變與缺失能參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停止,且PTEN基因的低表達(dá)或缺失與腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后存在相關(guān)性。此前研究證據(jù)提示,PTEN基因突變及表達(dá)能直接參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展,能通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖與遷移[5]。因此,本研究以卵巢癌及良性上皮性卵巢腫瘤患者為對象,探討卵巢癌患者PTEN基因突變情況、mRNA表達(dá)水平及其對卵巢癌的臨床診斷價值,現(xiàn)報道如下。

    1資料與方法

    1.1一般資料

    選擇2016年1月至2020年2月在溫州市中醫(yī)院進(jìn)行診治的卵巢癌患者58例為觀察組,觀察組年齡介于28~52歲,平均年齡(35.79±5.73)歲;腫瘤直徑介于2~7cm,平均直徑(4.34±0.63)cm;組織學(xué)分型為:漿液性囊腺癌21例,粘液性囊腺癌18例,卵巢內(nèi)膜性癌14例,透明細(xì)胞癌5例;組織分化程度為:高分化7例,中分化37例,低分化14例;臨床分期為:Ⅰ~Ⅱ期34例,Ⅲ~Ⅳ期24例。選擇同期進(jìn)行治療的良性上皮性卵巢腫瘤患者71例為對照組,對照組年齡介于29~53歲,平均年齡(36.11±5.74)歲。研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)為:①符合卵巢癌和良性上皮性卵巢腫瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];②均行手術(shù)治療,術(shù)中留取病灶組織;③均完成PTEN基因突變及mRNA水平測定,且患者均可耐受;④對本研究知情且同意參加者。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并認(rèn)知功能異常、自身免疫系統(tǒng)疾病者;②患者留取病灶組織前已接受激素或放化療治療;③合并精神異常、其他部位腫瘤或嚴(yán)重肝腎功能異常者。經(jīng)對比,兩組患者的一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),具有可比性。本研究方案已經(jīng)由溫州市中醫(yī)院倫理委員會審核及批準(zhǔn),且所有研究對象均已簽署知情同意書。

    1.2檢測方法

    1.2.1 PENT基因突變測定

    所有患者均行手術(shù)治療,且術(shù)中留取病灶組織,并將獲得的組織立即放置在液氮中,完成30min速凍后,將其放置在-70℃冰箱中;部分病灶組織采用濃度為10.0%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋后,制備4μm切片備用。采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)完成不同組織中PTEN基因突變部位,并完成擴(kuò)增,正向引物:5′-TCCAATAGAAAAATGGTG-3′;反向引物:5′-TGCCCCGATGTAATAAAT-3′;引物長度196nt。取上述經(jīng)PCR擴(kuò)增的引物3μL,根據(jù)1∶5的比例放置在變性劑(含有甲酰胺98.0%、NaOH溶液200mmol/L、EDTA 20mmol/L、溴酚藍(lán)0.05%及二甲苯青0.05%)中充分混合,在98℃下完成10min變性,完成后立即完成5min水浴。取上述獲得的混合溶液,完成聚丙烯酰胺凝膠電泳,從而獲得銀染顯帶,將DNA異常的擴(kuò)增產(chǎn)物送外檢,完成相應(yīng)序列的測定[7]。

    1.2.2 PENT mRNA表達(dá)水平測定

    取上述分離的組織標(biāo)本,向標(biāo)本中加入Trizol 500μL,充分混合后轉(zhuǎn)移到離心管1.0mL,振蕩5min后,靜置。向各組標(biāo)本中加入氯仿200μL,振蕩15s,靜置5min后離心15min,離心速度12 000rpm。完畢后加入預(yù)冷的乙醇(濃度為75.0%)1mL,常溫下放置7min至干燥,經(jīng)紫外分光度儀A260下測定吸光度值。采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定各組樣品中PENTmRNA的表達(dá)水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要完成PCR參數(shù)設(shè)置:30℃下10min;42℃下30min;99℃下5min;5℃下5min,合計(jì)完成循環(huán)35個,72℃下10min延長,獲得最終產(chǎn)物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳,β-actin為內(nèi)對照,引物見表1[8]。

    表1 PTEN mRNA引物設(shè)計(jì)

    1.3觀察指標(biāo)

    ①觀察卵巢癌組織中PTEN基因突變情況;②對比觀察組和對照組的PTEN mRNA水平差異;③收集患者的年齡、病理類型、分化類型及臨床分期,比較觀察組不同年齡、分化類型、病理組織類型及臨床分期下PTEN mRNA水平差異;④繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,分析PTEN mRNA水平在卵巢癌患者中的診斷效能。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2結(jié)果

    2.1 卵巢癌組織中PTEN基因突變

    58例卵巢癌組織中,有35例檢出PTEN基因突變,均為外顯子5突變,多分布在中分化及低分化癌中;其中卵巢內(nèi)膜性癌11例,透明細(xì)胞癌4例,漿液性囊腺癌13例,粘液性囊腺癌7例。突變部位為外顯子5第5位密碼子T→C,見圖1。

    注:突變部位為PTEN基因外顯子5第5位密碼子T→C。

    2.2兩組患者PTEN mRNA水平的比較

    觀察組PTEN mRNA水平為顯著低于對照組(0.334±0.097 vs 0.831±0.109,t=6.391,P<0.001),見表2。

    表2 兩組PTEN mRNA水平的比較

    2.3不同病理特征下卵巢癌患者的PTEN mRNA表達(dá)水平

    不同年齡分層下,卵巢癌患者的PTEN mRNA水平無顯著差異(t=0.334,P=0.691)。不同分化類型及病理組織類型分層下,卵巢癌患者的PTEN mRNA水平分布具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.891、7.998,P<0.001)臨床分期為Ⅰ~Ⅱ期的卵巢癌患者PTEN mRNA水平顯著高于Ⅲ~Ⅳ期患者(t=6.143,P<0.001),見表3。

    表3 不同病理特征下卵巢癌患者的PTEN mRNA表達(dá)水平比較

    2.4 PTEN mRNA水平對卵巢癌的診斷價值

    ROC曲線結(jié)果顯示,PTEN mRNA水平診斷卵巢癌的AUC為0.873(P<0.05),最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)的診斷靈敏度和特異度分別為85.71%、71.23%,見圖2。

    圖2 PTEN mRNA水平診斷卵巢癌的ROC曲線

    3討論

    3.1 PTEN基因在卵巢癌細(xì)胞中的突變

    卵巢癌是女性發(fā)生率較高的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于宮頸癌、子宮癌,具有較高的死亡率[9]。既往研究表明[10],惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡存在緊密的聯(lián)系。PTEN基因?qū)儆谌梭w中較為常見的抑癌基因,位于染色體10q23,含9個外顯子和8個內(nèi)含子,其編碼的蛋白與張力蛋白、輔助蛋白相似[11]。既往研究表明[11],PTEN基因編碼的蛋白能提高相關(guān)蛋白活性,能影響磷酸絲氨酸/蘇氨酸和磷酸酪氨酸殘基脫磷酸化,可負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動、浸潤與轉(zhuǎn)移。此外,PTEN還具有脂質(zhì)磷酸酶活性,通過一系列作用使細(xì)胞周期阻滯在G1期,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。PTEN基因能借助多種信號通路、途徑等抑制細(xì)胞的增殖活性,故其突變多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中,58例卵巢癌組織中檢出35例攜帶PTEN基因突變,多分布在中分化、低分化癌中,且均為外顯子5突變。此前研究證據(jù)也表明,PTEN基因外顯子5突變將改變編碼產(chǎn)物的磷酸酶結(jié)構(gòu)域,進(jìn)而使其功能異常[13]。

    3.2 PTEN mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)及意義

    本研究結(jié)果顯示,觀察組PTEN mRNA水平低于對照組(P<0.05),說明PTEN基因在卵巢癌患者中呈低表達(dá)水平。且本研究還發(fā)現(xiàn),卵巢癌組織中PTEN mRNA表達(dá)水平與患者的分化類型、病理組織類型及臨床分期密切相關(guān),低分化、Ⅲ~Ⅳ期及卵巢內(nèi)膜性癌患者的PTEN mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào),提示其表達(dá)水平或可反映患者的疾病嚴(yán)重程度,可用于輔助判斷患者的病理分型、分化程度及臨床分期,進(jìn)而用于指導(dǎo)臨床診療。且本研究結(jié)論與此前類似研究結(jié)論較為一致[14]。其原因可能降低細(xì)胞粘附和凋亡、提高細(xì)胞運(yùn)動性和增值、促進(jìn)心血管形成等過程相關(guān)[12]。但仍需開展更多大樣本研究,進(jìn)一步明確PTEN mRNA表達(dá)水平與患者的分化類型、病理組織類型及臨床分期的量化關(guān)系,助力卵巢癌個體化治療。

    3.3 PTEN mRNA水平對卵巢癌的診斷價值

    為了進(jìn)一步分析PTEN mRNA對卵巢癌的診斷價值,本研究進(jìn)一步構(gòu)建ROC曲線,結(jié)果顯示,PTEN mRNA水平診斷卵巢癌的AUC為0.873(P<0.05),最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)的診斷靈敏度和特異度分別為85.71%、71.23%,提示較高的診斷價值。故臨床上應(yīng)加強(qiáng)卵巢癌患者的PTEN基因測定,以便于評估患者分期、疾病嚴(yán)重程度,并根據(jù)測定結(jié)果制定治療方案,促進(jìn)患者恢復(fù)。

    綜上所述,卵巢癌患者常伴有PTEN基因突變,該基因mRNA水平可能因分化類型、病理組織類型及臨床分期的分布而異,且對卵巢癌的診斷具有重要價值,有望成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。

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