膠質(zhì)母細(xì)胞瘤長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜分析

朱鎮(zhèn)宇，黃 翔，孫俊龍，施金龍

（1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇226001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科）

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)腦腫瘤[1]，占成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤的75%[2]。在世界衛(wèi)生組織（WHO）2016年更新版中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）屬于Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤，惡性程度最高，預(yù)后不良。傳統(tǒng)手術(shù)及放療對(duì)GBM患者生存期改善的效果不佳，因此探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找新的診療方法具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸[3-4]，越來(lái)越多的研究報(bào)道LncRNAs異常表達(dá)可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)病過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移[5-7]。LncRNAs異常表達(dá)可作為膠質(zhì)瘤早期診斷的生物標(biāo)志物，并可作為治療靶點(diǎn)[8-9]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序獲取GBM的lncRNAs表達(dá)譜，對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行基因本體（GO）富集化分析和通路富集化分析，以期探索GBM新的診療方法。

1 材料與方法

1.1 患者與樣本招募 6例腦外傷患者和6例經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診的GBM患者，腦外傷患者中男性3例，女性3例，年齡35～64歲，GBM患者中男性3例，女性3例，年齡43～72歲。手術(shù)切取腦外傷患者正常腦組織和GBM患者腫瘤組織，于60 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃保存。兩組患者均無(wú)其他嚴(yán)重疾病，GBM患者未接受過(guò)化療或放療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 RNA文庫(kù)構(gòu)建及RNA測(cè)序 使用Trizol試劑（Invitgen，Cat No.15596-026，USA）從腦組織樣本中提取總RNA，使用Ribo-Zero rRNA去除試劑盒（Illumina，USA）從總RNA樣品中去除rRNA，然后利用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit（Illumina，USA）構(gòu)建RNA文庫(kù)。對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)用BioAnalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，USA）進(jìn)行量化。將10-pM文庫(kù)變性為單鏈DNA分子，在Illumina Flow細(xì)胞上捕獲，原位擴(kuò)增成簇，擴(kuò)增150個(gè)循環(huán)，并在Illumina HiSeq Sequencer上進(jìn)行測(cè)序。用hisat 2軟件將生成的高質(zhì)量reads與人類(lèi)參考基因組（UCSC hg19）比對(duì)。然后在EnSembl基因注釋文件的指導(dǎo)下，使用cuffdiff軟件以每百萬(wàn)映射讀數(shù)轉(zhuǎn)錄本（FPKM）值為單位的片段來(lái)揭示lncRNAs的表達(dá)譜，隨后鑒定差異表達(dá)的lncRNA。

1.3 GO富集分析 將GBM中差異表達(dá)基因（DEGs）映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontolo gy），基于“GO::TermFinder”應(yīng)用超幾何分布檢驗(yàn)，在DEGs輸入列表中查找顯著豐富的GO項(xiàng)（http://smd.stanford.edu/help/GO-TermFinder/GO_TermFinder_help.shtml），采用Bonferroni校正P值。以P≤0.05的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）作為閾值，滿(mǎn)足此條件的GO項(xiàng)被定義為顯著富集。

1.4 通路富集分析 根據(jù)京都基因和基因組學(xué)百科全書(shū)（KEGG），通路富集分析用來(lái)確定與通路相關(guān)的DEGs。經(jīng)FDR校正的P≤0.05被定義為顯著富集，以Cytoscape生成通路圖形表示。

2 結(jié) 果

2.1 GBM組織與正常腦組織中差異表達(dá)的lncRNAs通過(guò)對(duì)6例正常腦組織和6例GBM組織進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得968個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs。與正常腦組織相比，GBM組織中有399個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)，569個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)（圖1）。從中篩選出20個(gè)差異表達(dá)最顯著的lncRNAs，其中5個(gè)表達(dá)上調(diào)（表1），15個(gè)表達(dá)下調(diào)（表2）。

圖1 差異表達(dá)LncRNAs火山圖

表1 GBM中顯著上調(diào)的5個(gè)lncRNAs

表2 GBM中顯著下調(diào)的15個(gè)lncRNAs

2.2 GBM中差異表達(dá)的lncRNAs GO富集分析GO分析顯示了與分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和生物過(guò)程（BP）三個(gè)類(lèi)別相關(guān)的條目（圖2A-C），三個(gè)類(lèi)別中10個(gè)最豐富的小分類(lèi)（按富集分?jǐn)?shù)降序排列）如圖2D-F所示。

2.3 GBM中差異表達(dá)的lncRNAs通路富集分析 KEGG通路分析顯示，差異表達(dá)的lncRNAs在多個(gè)重要通路上顯著富集。圖3A中點(diǎn)圖顯示重要通路8個(gè)最高富集分?jǐn)?shù)（log10pvalue最低），圖3B顯示參與癌癥通路的lncRNA調(diào)控作用。

圖2 差異表達(dá)的lncRNA的GO富集分析

3 討 論

隨著新的研究技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的高通量測(cè)序用于分析腫瘤的基因表達(dá)，從而在腫瘤中發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的lncRNAs[10-11]。王湘玥等[12]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)GBM瘤體和瘤周組織差異表達(dá)的lncRNA MIR210HG，并證實(shí)其可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，但具體調(diào)控機(jī)制有待深入研究。韓艷玲等[13]通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)GBM組織中l(wèi)ncRNA MTHFD2相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組織，進(jìn)一步研究證實(shí)下調(diào)lncRNA MTHFD2表達(dá)可降低GBM細(xì)胞的增殖和遷移能力，增強(qiáng)對(duì)化療藥物替莫唑銨的敏感性，提示其可能為GBM潛在的治療靶標(biāo)。GBM的預(yù)后不良，主要是由于缺乏準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物，對(duì)發(fā)病機(jī)制缺乏了解，從而導(dǎo)致診斷延遲和治療效果不佳。因此，迫切需要更好地了解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的生物標(biāo)志物和準(zhǔn)確的治療靶點(diǎn)。然而，目前尚無(wú)對(duì)在GBM中多種差異表達(dá)lncRNAs的各種功能進(jìn)行描述的文獻(xiàn)報(bào)道。

圖3 差異表達(dá)的lncRNA的通路富集分析

相較于一代測(cè)序，二代測(cè)序具有通量高，成本低而準(zhǔn)確性無(wú)較大差別的優(yōu)點(diǎn)。本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)正常組織與GBM組織差異表達(dá)的968個(gè)lncRNAs，GBM組織中有399個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)，569個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)，從中篩選出20個(gè)差異表達(dá)最顯著的lncRNAs，其中5個(gè)表達(dá)上調(diào)，15個(gè)表達(dá)下調(diào)。尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道這20個(gè)差異表達(dá)最顯著的lncRNAs在腫瘤中的作用。為了解GBM中差異表達(dá)的lncRNAs的功能作用，本研究采用GO富集分析和通路富集分析。GO分析表明，這些lncRNA在與GBM密切相關(guān)的單細(xì)胞行為、突觸部分等顯著富集。通路富集化分析也表明，差異表達(dá)的lncRNAs在“谷氨酸能突觸”、“Ras信號(hào)通路”、“酒精成癮”、“ErbB信號(hào)通路”中顯著富集。

無(wú)論檢測(cè)表達(dá)水平的技術(shù)和所使用的樣本大小如何，因?yàn)楸磉_(dá)是隨機(jī)過(guò)程，實(shí)際的基因表達(dá)水平在個(gè)體中是可變的，分析數(shù)據(jù)可能不足以反映這些個(gè)體的實(shí)際表達(dá)水平。但是，生物變異性會(huì)隨著樣本規(guī)模的增大而降低，我們今后將采用更多的樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，在本研究中與正常組織相比，GBM中存在眾多差異表達(dá)的lncRNAs，這些lncRNAs在GBM重要生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞組分，分子功能以及多種信號(hào)通路中顯著富集，為探索新的GBM診療方法提供可靠的研究方向。