白介素-31基因多態(tài)性與隱睪發(fā)病易感性的相關(guān)性*

黃貴閩 曹貴華 唐鐵龍 譚春林

(1.樂(lè)山市人民醫(yī)院泌尿外科，四川 樂(lè)山 614000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

隱睪是新生男嬰最常見(jiàn)的先天性畸形之一，約30%的早產(chǎn)兒和3%～5%的足月兒患有隱睪[1]。隱睪是一種中度畸形，是發(fā)生不育和睪丸癌等并發(fā)癥的重要危險(xiǎn)因素。隱睪常常作為一種孤立性疾病發(fā)生，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但可能是多因素的，涉及遺傳和環(huán)境因素[2-4]。白介素-31(IL-31)是新近發(fā)現(xiàn)的GP130/IL-6細(xì)胞因子家族成員。IL-31主要由CD4+T細(xì)胞分泌。IL-31信號(hào)通過(guò)與IL-31受體A(IL-31RA)和抑瘤素M受體(OSMR)所組成的異源二聚體功能受體復(fù)合物結(jié)合而傳導(dǎo)，能在不同程度上激活Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路[5-8]。促炎癥細(xì)胞因子IL-31能夠在眾多免疫過(guò)程中誘導(dǎo)IL-6的分泌，而IL-6基因的表達(dá)水平與隱睪發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[9-10]。因此，推測(cè)隱睪發(fā)病可能與IL-31相關(guān)。研究表明，IL-31參與了神經(jīng)、免疫、生殖、呼吸、運(yùn)動(dòng)等系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育。但至今尚無(wú)IL-31與隱睪發(fā)病的相關(guān)報(bào)道。本研究中，我們探究IL-31基因rs7977932(C/G)和rs4758680(C/A)多態(tài)性在中國(guó)人群隱睪的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月～2015年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和樂(lè)山市人民醫(yī)院接受診療的隱睪患者。所選取的隱睪患者(僅為孤立性隱睪病例)和健康個(gè)體進(jìn)行病例-對(duì)照研究。這些患者在出生后不久便進(jìn)行體格檢查，并在月齡3個(gè)月時(shí)再次進(jìn)行檢查，以確定其隱睪情況。選取同期該院就診的無(wú)血緣關(guān)系并接受包皮切除術(shù)的健康人群作為對(duì)照組。早產(chǎn)兒、低出生體重嬰兒和有其他嚴(yán)重疾病或系統(tǒng)性疾病個(gè)人史或家族史的個(gè)體均不被納入研究范圍之內(nèi)。本研究應(yīng)用劉毅東[12]提及的隱睪的定義和相關(guān)體格檢查方法進(jìn)行疾病的診斷。所有的檢查都是在溫暖的條件下對(duì)仰臥姿勢(shì)的孩子進(jìn)行。睪丸在其正常下降的路徑上經(jīng)過(guò)持續(xù)、穩(wěn)定而非暴力的牽拉到最遠(yuǎn)端的位置后被記錄為最終的睪丸位置。對(duì)于隱睪這一診斷在進(jìn)行睪丸下降固定術(shù)前，即病人1歲左右時(shí)再次確認(rèn)。在所有病例中，單側(cè)隱睪97例，雙側(cè)隱睪15例。在雙側(cè)隱睪病例中，隱睪患者睪丸位置由兩側(cè)較高者決定并記錄。共有32例、27例、24例、19例和10例隱睪患者的睪丸位置分別位于腹股溝淺囊、陰囊上區(qū)、外環(huán)口、腹股溝管和內(nèi)環(huán)口。對(duì)照組人群均于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受包皮切除術(shù)。所有研究對(duì)象(包括病例組和對(duì)照組)均為中國(guó)西南地區(qū)四川省的漢族人群。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、樂(lè)山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象的父母都得到書(shū)面同意書(shū)并簽字同意參加這項(xiàng)研究，對(duì)每名隱睪患者和對(duì)照組抽取5毫升外周靜脈血以備DNA提取。

1.2 DNA提取和基因分型 分別對(duì)IL-31基因rs7977932和rs4758680兩個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)進(jìn)行基因分型。每個(gè)樣本的基因組DNA是適量EDTA抗凝外周血樣品中采用DNA分離試劑盒(BioTeke，北京，中國(guó))提取。操作程序按照制造商說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法對(duì)所選的2個(gè)SNP進(jìn)行基因分型。使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3設(shè)計(jì)引物(http://bioinfo.ut.ee/primer3-4.0/primer3/)，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系中分別含PCR緩沖液，基因組DNA和0.1 μL的擴(kuò)增引物等。待PCR反應(yīng)結(jié)束后用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)產(chǎn)物分別進(jìn)行酶切、聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色等步驟。最后再隨機(jī)選取15%樣本采用DNA測(cè)序方法重復(fù)測(cè)量，兩次分型結(jié)果完全一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)直接計(jì)數(shù)獲得2個(gè)SNPs的基因型頻率。采用卡方(2)檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組人群進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。利用優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR)和95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)評(píng)價(jià)病例組和健康對(duì)照組在等位基因與基因型間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)。使用在線軟件SNPstats(https://www.snpstats.net/snpstats/)對(duì)此病例對(duì)照研究的基因型相關(guān)性檢驗(yàn)，遺傳模型分別包括共顯性、顯性、隱性和超顯性。

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-31基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率比較 本研究最終成功對(duì)112例病例組和425例對(duì)照組進(jìn)行基因分型。對(duì)照組的IL-31基因多態(tài)位點(diǎn)rs4758680和rs7977932的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(rs4758680:2=1.44,P>0.05,rs7977932:2=0.62,P>0.05)。病例組和對(duì)照組的2個(gè)SNPs的等位基因頻率分布情況，見(jiàn)表2。rs7977932位點(diǎn)的等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。對(duì)rs 4758680而言，病例組rs4758680的C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組(89%vs83%)；相反，病例組rs4758680的A等位基因頻率較對(duì)照組有所下降(11% vs 17%)。隱睪風(fēng)險(xiǎn)顯著降低與rs4758680位點(diǎn)的A等位基因相關(guān)(P=0.02，或=0.58，95% CI=0.37～0.92)。

表2 病例組及對(duì)照組IL-31基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率比較[n(×10-2)]Table 2 Allele frequencies of SNPs in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism risk

2.2 兩組IL-31基因rs7977932基因頻率比較 對(duì)IL-31基因rs7977932位點(diǎn)基因多態(tài)性分析表明，病例組與對(duì)照組的基因型頻率分布在共顯性、顯性、隱性和超顯性遺傳模型上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表3。

表3 病例組及對(duì)照組IL-31基因rs7977932基因型頻率比較[n(×10-2)] Table 3 Genotype frequencies of SNP rs7977932 in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism

2.3 兩組I-31基因rs4758680基因型頻率分布 IL-31基因rs4758680位點(diǎn)基因型頻率在共顯性、隱性、超顯性三種基因模型下，病例組與對(duì)照組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在顯性基因模型中，病例組中CC基因型頻率(79.5%)明顯高于對(duì)照組中CC基因型頻率(69.2%)；病例組中A堿基攜帶者(CA/AA基因型)頻率在中顯著低于對(duì)照組(20.5% vs 30.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.58,95%CI=0.35～0.96,p=0.03)，見(jiàn)表4。

表4 病例組及對(duì)照組IL-31基因rs4758680基因型頻率分布[n(×10-2)] Table 4 Genotype frequencies of SNP rs4758680 in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism

3 討論

人類(lèi)的IL-31基因位于染色體12q24.13上，該基因可以編碼一個(gè)由164個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[15]。IL-31是一種多向性細(xì)胞因子，具有造血調(diào)節(jié)、免疫、細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子和趨化因子的誘導(dǎo)等多種生物學(xué)功能；IL-31及其受體通路在多種免疫和炎性反應(yīng)中發(fā)揮其生物學(xué)功能，引起如炎癥性腸病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘和各型皮炎等在內(nèi)的各種自身免疫疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病[16-18]。Potashnik H等[19]人報(bào)道了在體外條件下，IL-6的分泌伴隨著異常數(shù)量的睪酮，而性發(fā)育不成熟小鼠睪丸組織中IL-6基因表達(dá)水平顯著高于其在成熟小鼠睪丸內(nèi)的水平，故IL-6可能參與調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育、生長(zhǎng)、增殖和分化等重要生理功能。有趣的是，IL-31作為一種新近發(fā)現(xiàn)的炎癥細(xì)胞因子，能夠在多種不同類(lèi)型的細(xì)胞中有效誘導(dǎo)促炎癥介質(zhì)的釋放，而這其中就包括IL-6[17-18，20]。因此，我們猜測(cè)IL-31可能通過(guò)某種途徑影響IL-6的釋放，并有可能進(jìn)一步影響隱睪的發(fā)展。

基因多態(tài)性包括DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性、DNA重復(fù)序列多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等種類(lèi)，且以后者最為多見(jiàn)。SNP可以作為疾病的病因、發(fā)病危險(xiǎn)因素，也可做為腫瘤標(biāo)記物、生物標(biāo)記物診斷某疾病，而且在評(píng)估治療方案的治療效果，判斷某個(gè)藥物的不良反應(yīng)及腫瘤的生存和預(yù)后等方面都有廣泛的研究。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)IL-31基因多態(tài)性與隱睪發(fā)病易感性之間相關(guān)性的研究[21-23]。本研究首次探究并證實(shí)了中國(guó)人群隱睪發(fā)病易感性與IL-31基因多態(tài)性的相關(guān)性。本研究中所選擇的兩個(gè)IL-31基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)均位于內(nèi)含子區(qū)域。對(duì)于rs4758680，在顯性遺傳模型中，患者與對(duì)照組之間的基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs4758680位于非編碼區(qū)，但其可能通過(guò)影響其他基因的表達(dá)產(chǎn)物而不是通過(guò)改變IL-31基因中的氨基酸序列影響IL-31的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)而改變隱睪發(fā)病的易感性。我們本研究所得到的數(shù)據(jù)與IL-31基因多態(tài)性擴(kuò)張性心肌病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的遺傳易感性的相關(guān)性研究結(jié)果相似[15,24]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，位于非編碼區(qū)的內(nèi)含子可以通過(guò)一種特殊的機(jī)制啟動(dòng)和增強(qiáng)基因在廣泛的生物群體中的表達(dá)，這種機(jī)制被稱為內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)[25]。盡管本實(shí)驗(yàn)中單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs7977932與隱睪發(fā)病易感性之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性，但這一觀察結(jié)果可能是由于本研究中樣本有限所致。因此，本實(shí)驗(yàn)不能得出rs7977932的SNPs與隱睪發(fā)病易感性不相關(guān)的結(jié)論，同時(shí)也應(yīng)該在更大的研究樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。我們的研究結(jié)果為炎癥相關(guān)因子IL-31基因多態(tài)性與隱睪的易感性的相關(guān)性提供了證據(jù)。

IL-31的基因多態(tài)性或血清表達(dá)水平已經(jīng)被用來(lái)確定多種疾病的易感性、預(yù)后或轉(zhuǎn)歸[15,26,27]。本研究探討了IL-31基因在隱睪發(fā)病中的潛在作用，并成功地確定了IL-31基因SNP與隱睪發(fā)病易感性之間的相關(guān)性。IL-31基因SNP等位基因和基因型頻率在隱睪患者與對(duì)照組之間也有顯著性差異。提示rs4758680位點(diǎn)的C等位基因可能是主要的易感因素。此外，rs4758680位點(diǎn)的A等位基因攜帶者(C/A-A/A基因型)可作為中國(guó)人群隱睪的一種新的保護(hù)因素。

4 結(jié)論

IL-31基因多態(tài)性與中國(guó)人群隱睪的遺傳易感性有關(guān)。與CC基因型相比，rs4758680的A等位基因攜帶者(CA/AA基因型)是隱睪遺傳易感性的保護(hù)因素。