激動髓樣細(xì)胞-2觸發(fā)受體減輕圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙*

田芳芳 呼芳芳 趙靜 王寧 馬磊

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710038)

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙(Perioperative neurocognitive disorders，PND)是指與術(shù)前相比,術(shù)后短期及長期學(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)心理學(xué)測試等執(zhí)行功能下降的一種臨床綜合征[1-2]。當(dāng)前眾多研究表明PND是重大手術(shù)后的重要并發(fā)癥[3-4]，其與不良結(jié)局密切相關(guān)[5-7]。但是，PND的發(fā)病機制仍然不明。有證據(jù)表明，外科創(chuàng)傷引起的炎癥在PND的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[8-9],且炎癥因子的高低與血漿和海馬組織中細(xì)胞因子水平的升高相平行，阻斷炎癥能夠減少記憶障礙[10-14]。髓樣細(xì)胞2-觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是TREM家族的免疫球蛋白樣受體，目前相關(guān)研究認(rèn)為細(xì)胞高表達(dá)TREM2在免疫監(jiān)視、細(xì)胞間相互作用和抑制潛在的炎癥反應(yīng)中起重要作用[15-17]。相反，當(dāng)細(xì)胞中缺乏TREM2則會增加促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[18]。因此，TREM2被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥的重要負(fù)性調(diào)節(jié)劑。但是，當(dāng)前還缺少TREM2在外科手術(shù)中參與調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和認(rèn)知功能的研究。本研究探討在骨科手術(shù)后，小鼠海馬中TREM2和促炎因子的表達(dá)情況，并探究改變TREM2表達(dá)是否可以改變小鼠的神經(jīng)炎癥以及學(xué)習(xí)和記憶障礙。

1 實驗和方法

1.1 實驗動物 動物實驗已獲得西安交通大學(xué)(中國西安)動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)，并按照其動物實驗指南進行。雄性野生型C57BL/6小鼠購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。在藥物干預(yù)或手術(shù)之前，將小鼠(4個月大)適應(yīng)性飼養(yǎng)至少一周，光照/黑暗周期為12小時，溫度為21±2℃，濕度為60%～70%。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗方案 實驗第一部分：驗證模型的成功及術(shù)后激動髓樣細(xì)胞-2 (TREM2)的表達(dá)，將20只雄性野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組和手術(shù)組兩組，每組各10只，對照組小鼠僅給予異氟烷麻醉，麻醉時間與手術(shù)組小鼠相同；手術(shù)組小鼠在異氟烷麻醉下接受脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)。在手術(shù)前24小時對小鼠進行恐懼條件訓(xùn)練，恐懼條件測試(Fear conditioning test,FCT)分別在術(shù)后1、3和7天進行,并采用曠場實驗評估小鼠的運動能力。在最后一次行為評估后，將動物處死進行western blot檢測TREM2的表達(dá)。(為排除異氟烷的干擾，本研究對對照組和手術(shù)組均進行了異氟烷麻醉處理，麻醉時間相同)。實驗第二部分：將40只小鼠隨機分為對照組、手術(shù)組、HSP60+手術(shù)組和TREM2-siRNA+HSP60+手術(shù)組4組，每組各10只。對照組小鼠僅給予異氟烷麻醉，麻醉時間與手術(shù)組小鼠相同；手術(shù)組小鼠在異氟烷麻醉下接受脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)。手術(shù)前30分鐘將TREM2-siRNA立體定向注射入側(cè)腦室，方法按照我們先前實驗，可使用亞甲藍(lán)檢測注射效率[19]。將選擇性TREM2受體激動劑熱休克蛋白60(HSP60)在麻醉蘇醒后立即腹腔注射(5μg/小鼠)，按前述方法每24小時注射一次，連續(xù)7天，在手術(shù)前24小時對小鼠進行恐懼條件訓(xùn)練。FCT分別在術(shù)后1、3和7天進行,并采用曠場實驗評估小鼠的運動能力。在最后一次行為評估后，一半小鼠(n=5)用于Western blot和ELISA分析，另一半(n=5)用于免疫熒光檢測，見圖1。

圖1 實驗流程圖Figure 1 Experimental protocol

1.2.2 手術(shù)模型 采用文獻報道方法[20],小鼠在異氟烷麻醉下接受了脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)，在膝蓋以下切開皮膚，暴露脛骨，將0.3毫米針頭插入髓腔以實施髓內(nèi)固定，然后于中點斷裂脛骨，消毒并縫合切口。手術(shù)持續(xù)約10分鐘，總麻醉時間約20分鐘。在手術(shù)過程中，使用加熱墊將小鼠的直腸溫度維持在(37±0.5)℃。麻醉后，將小鼠于加熱毯保持體溫直至完全蘇醒，返回飼養(yǎng)籠。為了減輕皮膚切口的疼痛，在切口處局部使用2%利多卡因溶液浸潤麻醉，并且于手術(shù)后在傷口中每天兩次施用1%鹽酸丁卡因凝膠3天。

1.2.3 曠場實驗 在恐懼條件訓(xùn)練和測試前15分鐘進行了曠場測試。于昏暗燈光下，將每只小鼠輕輕放在曠場的中心，讓其自由移動5分鐘。通過自動分析系統(tǒng)自動記錄運動過程。通過總的探索距離來測量小鼠的運動能力。在每次測試后，用75%的乙醇洗滌測試場地，以避免出現(xiàn)嗅覺提示。

1.2.4 條件性恐懼測試 采用文獻報道方法[20]，進行條件性恐懼測試過程，包括術(shù)前訓(xùn)練以及術(shù)后1、3和7天的測試。簡而言之，在手術(shù)前一天，對小鼠進行條件性恐懼訓(xùn)練以建立長期記憶。在測試階段，僅將小鼠放在測試室中5分鐘，不要用腳踩電擊。記錄潛伏期百分比(定義為小鼠不活動但呼吸的時間)。

1.2.5 小干擾RNA轉(zhuǎn)染 對C57BL/6小鼠體內(nèi)進行了小干擾RNA(siRNA)體內(nèi)轉(zhuǎn)染。簡而言之，立體定位坐標(biāo)為前囟部后0.4 mm，中線外側(cè)1.0 mm，顱骨表面下方2.5 mm，將不銹鋼套筒植入側(cè)腦室。根據(jù)制造商說明書，在手術(shù)前30分鐘，分別將2μL TREM2-siRNA的稀釋混合物立體定位注射到側(cè)腦室。

1.2.6 蛋白印跡分析(Western Blotting) 處理后收集小鼠的海馬組織蛋白，并如先前所述進行蛋白質(zhì)印跡分析[22]。使用了抗TREM2兔抗體(1∶200)和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶10000)。通過化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測抗原。圖像分析通過Image J軟件進行。

1.2.7 實時定量PCR 使用RNeasy試劑盒(美國QIAGEN)從冷凍海馬組織中提取RNA，而高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologies)用于反轉(zhuǎn)錄。使用ABI Prizm 7500熱循環(huán)儀，使用TaqMan引物(美國Life Technologies)和TaqMan Universal PCR Master Mix(美國Life Technologies)進行實時PCR，以GAPDH為參照，用2ΔΔCt法比較TREM2基因的表達(dá)水平[23]。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附測定 根據(jù)ELISA試劑盒方案，將海馬樣品在PBS中制備組織勻漿，離心(10,000 rpm，5分鐘)，收集上清液用于ELISA檢測。使用96孔板在450nm處測量吸光度，并測量白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)誘發(fā)小鼠PND的發(fā)生，并降低海馬中TREM2的表達(dá) 首先，我們探討了異氟烷麻醉下的手術(shù)是否可以誘發(fā)PND的發(fā)生以及術(shù)后海馬組織中TREM2的表達(dá)變化。分別在手術(shù)后1、3和7天FCT前15分鐘評估手術(shù)對運動能力的影響，通過在曠場內(nèi)5分鐘內(nèi)的總移動距離以評估運動能力。各組小鼠基線運動能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表示小鼠的運動能力不受手術(shù)影響，見圖2A～D。進行FCT的情境測試，以評估海馬依賴性記憶。與對照組相比，手術(shù)組小鼠術(shù)后1、3和7天的凍結(jié)時間均減少(P<0.05)，見圖2E-G。Western blot結(jié)果顯示：手術(shù)組小鼠海馬區(qū)TREM2表達(dá)下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2H-I。

圖2 手術(shù)對小鼠運動能力及學(xué)習(xí)記憶能力的影響Figure 2 The effect of surgery on the movement,learning and memory ability in mice注：A-D.曠場實驗小鼠運動總距離；E-G.條件性恐懼測試中術(shù)后1、3和7天凍結(jié)時間百分比統(tǒng)計圖；H-I.Western blot檢測海馬中TREM2的表達(dá)及統(tǒng)計結(jié)果(①P<0.05 表示與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，n=10)

2.2 選擇性TREM2受體激動劑HSP60降低了手術(shù)后PND的發(fā)生率，但是側(cè)腦室內(nèi)注射TREM2-siRNA消除了HSP60對小鼠的作用 分別在手術(shù)后1、3和7天FCT前15分鐘，評估手術(shù)和藥物治療對運動能力的影響。各組小鼠基線運動能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表示運動能力不受手術(shù)和藥物治療的影響，見圖3A-D。進行FCT的情境測試以評估海馬依賴性記憶。與對照組相比，手術(shù)后1、3和7天小鼠凍結(jié)時間均顯著減少(P<0.05)，見圖3E-G。與手術(shù)組相比，HSP60治療組在手術(shù)后三個時間點凍結(jié)時間明顯增加(P<0.05)，使用TREM2-siRNA可以顯著消除HSP60誘導(dǎo)的效應(yīng)(P<0.05)。

圖3 上調(diào)TREM2對小鼠運動能力以及依賴性記憶的影響Figure 3 The effect of TREM2 up-regulation on the movement and dependent memory of mice注：A-D.曠場實驗小鼠運動總距離；E-G.條件性恐懼測試中術(shù)后1、3和7天凝固時間百分比統(tǒng)計圖(①P<0.05為對照組vs手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，②P<0.05為手術(shù)組vsHSP60+手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，③P<0.05為HSP60+手術(shù)組vsTREM2-siRNA+HSP60+手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義n=10)

2.3 HSP60增加手術(shù)后海馬組織中TREM2的表達(dá)，而側(cè)腦室內(nèi)注射TREM2-siRNA可逆轉(zhuǎn)HSP60對小鼠的影響 手術(shù)誘導(dǎo)海馬組織TREM2表達(dá)降低。HSP60治療減輕了手術(shù)引起的TREM2下調(diào)，而TREM2-siRNA逆轉(zhuǎn)了HSP60的作用。Western blot與實時定量PCR分析結(jié)果顯示，與對照組相比，術(shù)后7天手術(shù)組小鼠海馬組織中TREM2表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與手術(shù)組相比，HSP60治療在術(shù)后7天導(dǎo)致TREM2表達(dá)增加(P<0.05)，而給予TREM2-siRNA逆轉(zhuǎn)了上述HSP60的作用(P<0.05)，見圖4。

圖4 HSP60對小鼠海馬組織中TREM2表達(dá)的影響Figure 4 The effect of HSP60 on TREM2 expression in mouse hippocampus注：A-B.Western blot檢測海馬中TREM2的表達(dá)及統(tǒng)計結(jié)果；C.實時定量PCR分析TREM2的表達(dá)(①P<0.05為對照組vs手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，②P<0.05為手術(shù)組vs HSP60+手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，③P<0.05為HSP60+手術(shù)組vs TREM2-siRNA+HSP60+手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，n=5)

2.4 HSP60減少手術(shù)后促炎因子釋放并增加抗炎和神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放，且腦室內(nèi)注射TREM2-siRNA可以消除HSP60對小鼠的影響 與對照組相比，手術(shù)后7天手術(shù)組小鼠海馬組織中TNF-α，IL-1β和IL-6水平明顯升高(P<0.05)，HSP60處理降低了TNF-α，IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)，給予TREM2-siRNA可以逆轉(zhuǎn)HSP60效應(yīng)(P<0.05)。以上結(jié)果表明，HSP60誘導(dǎo)的TREM2表達(dá)增加可以降低手術(shù)后腦組織的炎癥反應(yīng)，見圖5。

圖5 上調(diào)TREM2對小鼠腦炎性因子的影響Figure 5 The effects of TREM2 up-regulation on inflammatory factors in mice注：A-C.ELISA檢測海馬中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)及統(tǒng)計結(jié)果(①P<0.05為對照組vs手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，②P<0.05為手術(shù)組vs HSP60+手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，③P<0.05為HSP60+手術(shù)組vs TREM2-siRNA+HSP60+手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，n=5)

3 討論

本實驗的目的是探究異氟烷麻醉下接受脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)的成年小鼠的圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙、神經(jīng)炎癥和TREM2表達(dá)之間的關(guān)系。據(jù)我們所知，這是第一次探索TREM2對接受外科手術(shù)小鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響。此外，本實驗探究了TREM2激動劑HSP60對其上調(diào)和TREM2-siRNA對其下調(diào)對手術(shù)小鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響，并評估了與記憶功能密切相關(guān)的小鼠海馬組織中的炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，手術(shù)后小鼠海馬依賴性記憶受損，術(shù)后HSP60干預(yù)減輕了手術(shù)引起的記憶障礙，減少了促炎因子的釋放，而TREM2-siRNA逆轉(zhuǎn)了上述HSP60誘導(dǎo)的有益作用。

研究表明，異氟烷麻醉下手術(shù)可能會引起神經(jīng)炎癥，在小鼠中誘發(fā)PND，并損害海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶功能。本研究通過條件性恐懼測試檢測海馬功能[20-21]。神經(jīng)炎癥與認(rèn)知障礙有關(guān)，是PND的主要發(fā)病機制[21]。此外促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，已被廣泛研究為與認(rèn)知障礙相關(guān)的神經(jīng)炎癥介質(zhì)[21-22]。在本研究中，觀察到手術(shù)后海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，從而導(dǎo)致記憶障礙，這與文獻報道結(jié)果是一致的，表明神經(jīng)炎癥和術(shù)后認(rèn)知障礙同時發(fā)生。此外毫無疑問，異氟烷對小鼠認(rèn)知功能障礙具有一定的影響[23]，因此在本研究中，為最大的降低麻醉藥物帶來的負(fù)面效應(yīng)，我們對對照組和手術(shù)組均進行了異氟烷的麻醉，以盡可能的保證實驗結(jié)果的可靠性。

TREM家族受體僅在髓樣細(xì)胞上被檢測到，并認(rèn)為與先天免疫反應(yīng)有關(guān)[24]。TREM2基因位于小鼠染色體17C上[25]，在大腦中，TREM2在小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，最近發(fā)現(xiàn)是阿爾茨海默癥的危險基因[26-28]。TREM2還通過調(diào)節(jié)炎性因子的釋放來調(diào)節(jié)周圍組織的炎性過程[29]。TREM2缺乏在實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中引起不受控制的炎癥[18]。因此，TREM2在神經(jīng)炎癥的負(fù)調(diào)控中起關(guān)鍵作用[30]。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)手術(shù)并沒有損害小鼠的運動能力，各組小鼠間的總運動距離間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外，手術(shù)后TREM2表達(dá)降低，但通過使用選擇性TREM2激動劑HSP60后，小鼠海馬組織中TREM2的表達(dá)顯著增加，從而改善了學(xué)習(xí)和記憶功能，減輕了小鼠的神經(jīng)炎癥。但是，TREM2-siRNA消除了HSP60誘導(dǎo)的TREM2表達(dá)的增加，并逆轉(zhuǎn)了HSP60誘導(dǎo)的對學(xué)習(xí)和記憶功能的改善以及對大腦炎癥的減輕作用。因此，TREM2的上調(diào)可能與減輕神經(jīng)炎癥以及改善學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)，并最終減少PND的發(fā)生。

本研究仍然存在一些局限性。首先，我們的研究強調(diào)了小鼠海馬組織中由手術(shù)引起的神經(jīng)炎癥，但沒有評估全身性炎癥。其次，在這項研究中，我們僅使用siRNA下調(diào)TREM2表達(dá)，在未來的工作中我們將使用基因敲除小鼠來驗證我們的發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié)論與啟示

本研究表明TREM2的表達(dá)增加對PND具有潛在的保護作用。選擇性TREM2激動劑HSP60的治療可減輕神經(jīng)炎癥，并改善術(shù)后的學(xué)習(xí)和記憶功能，給予TREM2-siRNA可逆轉(zhuǎn)HSP60的有益作用。本文研究結(jié)果表明，TREM2可能是PND治療的潛在新靶點。