高通量測序與傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法在溱潼魚丸微生物群落分析中的應(yīng)用對比研究

張璟晶，彭慶旺，陳玉勇，唐勁松，秦金燕

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

溱潼魚丸是江蘇省泰州市姜堰區(qū)傳統(tǒng)魚糜制品小吃，從古至今制作工藝講究，保持和突出了傳統(tǒng)產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)，但溱潼魚丸因工藝的特殊性在原料及加工過程中會(huì)帶入微生物，也可能由于包裝或儲(chǔ)藏等因素而更容易出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象。目前國內(nèi)對魚丸的研究主要集中在魚丸加工工藝的研究和影響魚丸質(zhì)量的因素上，而對魚丸中微生物結(jié)構(gòu)的分析及導(dǎo)致腐敗的微生物研究鑒定甚少，對溱潼魚丸中微生物群落分析及腐敗菌的鑒別尚未見報(bào)道。

目前常通過分離純化、個(gè)體形態(tài)鑒定、生理生化鑒定等對微生物種類進(jìn)行鑒定[1-2]。以16SrDNA特定可變高通量測序是近年研究微生物種類多樣性的新手段，對于研究微生物群落的組成及比例具有明顯的優(yōu)勢[3]。目前該技術(shù)應(yīng)用在不同種類食品中的微生物分析鑒定[4-6]，但該技術(shù)在水產(chǎn)品魚糜制品中的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。本文采用IIIumina HiSeq第二代測序技術(shù)對溱潼魚丸在4℃下儲(chǔ)藏期內(nèi)微生物的多樣性進(jìn)行測序，并與傳統(tǒng)方法結(jié)合，對溱潼魚丸中微生物結(jié)構(gòu)的多樣性進(jìn)行分析，對主要微生物進(jìn)行分離鑒定，研究溱潼魚丸中微生物的種類及其在儲(chǔ)藏期間微生物的變化，為下一步魚丸的防腐保鮮、延長產(chǎn)品的保質(zhì)期奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用魚丸購自溱潼農(nóng)貿(mào)超市。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）、營養(yǎng)肉湯（NB肉湯）、革蘭氏染色液、微生物生理生化微量鑒定管等：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR擴(kuò)增試劑及引物、DNA提取試劑盒、溶菌酶等：生工生物（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

EL270型電子天平：梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；LDZX30FA型立式壓力蒸汽滅菌鍋、HPX9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-ZFD型超凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PTC200型PCR擴(kuò)增儀、YLN2000A型凝膠成像分析儀：生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚丸預(yù)處理

將從市場買來的魚丸表面用75%的無水乙醇擦拭后晾干，于無菌環(huán)境下定量分裝，至無菌袋中，每袋10 g，分為兩組（A組和B組），于4℃低溫下儲(chǔ)藏。

1.2.2 魚丸預(yù)增菌處理

將魚丸分組進(jìn)行取樣，A組魚丸按儲(chǔ)藏時(shí)間在第1天和第3天取樣后，使用蛋白胨肉湯進(jìn)行30℃過夜增菌培養(yǎng)，記為A1、A3；B組魚丸于第1天和第3天取樣后不增菌，記為B1、B3。

1.2.3 平板分離培養(yǎng)和菌株種類鑒定

1.2.3.1 平板分離培養(yǎng)

將B組魚丸分別在第1、3、5、7、9天進(jìn)行取樣，每次取一袋，加入90 mL無菌水，均質(zhì)后制成10-1稀釋液，然后進(jìn)行10倍系列梯度稀釋[7]。選擇適宜的稀釋液混勻后分別取1 mL加入無菌平皿，后倒入無菌營養(yǎng)瓊脂（NA）20 mL，混勻，冷卻凝固后，將平皿倒置于培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)（72±2）h。

1.2.3.2 菌株種類的鑒定

觀察在NA培養(yǎng)基上分離得到的菌落的特征，挑取具有不同典型形態(tài)特征的菌落，分別進(jìn)行分離純化，以獲得純種，后保存在試管斜面中，備用。

參照Bagge-Ravn等[8]的方法以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對分離得到的純種進(jìn)行鑒定。

1.2.4 高通量測序分析方法

1.2.4.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

將分組魚丸按不同時(shí)間分別取樣約10 g，放入滅菌袋中，磨碎，在超凈工作臺(tái)中加入90 mL生理鹽水于滅菌的錐形瓶中，振蕩30 min。將得到的渾濁液轉(zhuǎn)移到離心管中，于4℃下以4 000 r/min離心10 min，去上清液于離心管中，繼續(xù)于4℃下以1 000 r/min離心20min，將沉淀轉(zhuǎn)移EP管中，并于-20℃下保存[10-11]。

PCR反應(yīng)體系為50μL，包括：2μL DNA模板、1μL正向引物、1μL反向引物、25μL 2xTap MasterMix、21μL dd H2O。PCR反應(yīng)過程：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，1個(gè)循環(huán)。正向引物8F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1541R（5’-AAG GAGGTGATCCAACCGCA-3’）。

1.2.4.2 測序數(shù)據(jù)處理

委托生工生物（上海）股份有限公司對以上樣品進(jìn)行宏基因組微生物分類測序。

對IIIumina HiSeq測定溱潼魚丸中微生物群落的結(jié)果進(jìn)行分析，去除3’端引物接頭序列，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系將成對reads拼接成一條序列，根據(jù)各樣本barcode序列從融合后數(shù)據(jù)中分割出樣本數(shù)據(jù)，去除各樣本中reads尾部質(zhì)量值在20以下的堿基，切除reads中含N部分序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列，長度閾值200 bp，最后再對低復(fù)雜的序列進(jìn)行過濾，去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列，得到有效數(shù)據(jù)。

1.2.4.3 操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種注釋

利用Usearch軟件[12]對“1.2.4.2”得到的序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類操作。將所測得序列在97%相似水平下聚類為不同的操作分類單元（OTUs），進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離鑒定結(jié)果分析

采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對各樣品中可以培養(yǎng)的微生物進(jìn)行了分離與純化，通過選取菌落形態(tài)各異的菌株共獲得37株菌株，經(jīng)革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定等進(jìn)行初步分類鑒定，結(jié)果見表1。由表1可以看出，假單胞菌屬在所鑒定菌株總數(shù)中占比較高（45.9%），葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、微球菌屬和芽孢桿菌屬也占有一定比例。傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離鑒定的方法受環(huán)境培養(yǎng)條件影響較大，往往不能鑒定出冷藏魚丸中的所有微生物種類，且該方法一般耗時(shí)較長，各種魚糜制品附著微生物群落組成差異不盡相同。

2.2 高通量測序結(jié)果

2.2.1 OTU物種注釋

本研究通過采用Illumina Hiseq測定B組魚丸樣本得到原始序列條數(shù)259 438個(gè)，過濾掉低質(zhì)量序列后，有效序列總數(shù)為253 397個(gè)。根據(jù)Barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾得到有效數(shù)據(jù)，并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，得到溱潼魚丸中群落結(jié)果組成，并統(tǒng)計(jì)得到各個(gè)樣品在不同OTUs中豐度信息（序列數(shù)）。

采用Krona軟件對B1樣品中所附著的細(xì)菌OTUs進(jìn)行物種注釋，結(jié)果如圖1所示。共鑒定出21個(gè)門，39個(gè)綱，49個(gè)目，49個(gè)科，52個(gè)屬。圖1中由最內(nèi)圈向外依次分別代表溱潼魚丸中附著細(xì)菌在界、門、綱、目、科、屬水平下的物種組成，不同顏色的扇形代表不同菌屬，扇形面積的大小代表不同OTUs注釋結(jié)果的相對比例。

從圖1中可以看出：魚丸中微生物種類在門水平上，以變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）為主，分別占46%和31%；在綱水平上群落組成，變形菌綱（Gammaproteobacteria）屬于優(yōu)勢菌綱，占37%；放線菌綱（Actinobacteria）次之，占31%；在目水平上群落組成，假單胞目（Pseudomonadales）占33%；放線菌目（Actinomycetales）次之，占31%；在科水平上群落組成，優(yōu)勢菌科為微球菌科（Micrococcineae）占31%，其次為莫拉式菌科（Moraxellaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae），分別占18%和15%；在屬水平群落組成，假單胞菌屬（Pseudomonas）是絕對優(yōu)勢菌屬，占15%；其余主要菌屬為考克氏菌屬（Kocuria）占12%，皮生球菌屬（Dermacoccus）占11%，水棲菌屬（Enhydrobacter）占11%，鏈球菌屬（Streptococcus）占5%，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）占5%，乳球菌屬（Lactcoccus）占4%，葡萄球菌屬（Staphylococcus）占3%。

圖1 物種注釋結(jié)果Fig.1 Species annotation results

2.2.2 分類與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

通過使用GraPhIAn和iTOL軟件，選擇豐度排名靠前的20個(gè)菌屬（以字母A～T進(jìn)行表示）所對應(yīng)的OTUs數(shù)據(jù)，構(gòu)建分類與系統(tǒng)發(fā)育圖（圖2）。圖中顯示最里圈為代表序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，分別用不同的顏色代表不同的菌屬，其中系統(tǒng)發(fā)育樹中圈和星號的大小代表菌屬豐度大小。第2層為外圍熱力圖，每一環(huán)代表不同的樣本，OTUs的相對豐度分布由顏色深淺變化表示；第3層是OTUs注釋可信度分布，柱子的高度表示其可信度。

由圖2可以看出，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）相對豐度較高，同時(shí)兩種菌屬在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上也很接近。大量研究表明，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）是典型的耐寒性細(xì)菌，主要是水產(chǎn)魚類表面的優(yōu)勢腐敗菌，在很多水產(chǎn)加工制品和冷藏肉類調(diào)理食品中，嗜冷桿菌屬仍然是其主要的優(yōu)勢腐敗菌[13-15]。

圖2 魚丸樣品OTUs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖Fig.2 Phylogenetic relationshipsof OTUs fromfish balls

假單胞菌（Pseudomonas）也具有一定的耐冷特性，冷藏條件下也是肉類腐敗過程中最主要的腐敗菌之一，當(dāng)假單胞菌的菌數(shù)達(dá)到一定水平，就會(huì)導(dǎo)致肉品產(chǎn)生異味[16-17]。

2.2.3 溱潼魚丸樣本聚類樹圖分析

通過樣本聚類樹圖可以直觀看出溱潼魚丸多個(gè)樣品間的相似性和差異性，結(jié)果如圖3所示。A組樣品經(jīng)過室溫增菌后進(jìn)行菌屬分析檢測，從魚丸中所具有微生物菌屬種類數(shù)量來看與B組（未增菌組）相差并不大，但隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，其中主要菌屬所占比例變化較大，尤其是假單胞菌屬（Pseudomonas）比例大幅度增加，說明在室溫下假單胞菌屬（Pseudomonas）在溱潼魚丸中的生長繁殖速度遠(yuǎn)快于其他菌屬。而B組樣品隨著時(shí)間的延長，其菌屬的種類逐漸趨于單一，說明在4℃低溫下，嗜冷性或耐冷性的菌屬逐漸適應(yīng)了環(huán)境在溱潼魚丸中逐漸占有優(yōu)勢，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）幾乎呈交替上升的趨勢，從而對其他菌屬的生長造成了一定的影響。隨著冷藏時(shí)間的延長，B7與B3、B5樣品中的微生物細(xì)菌菌群的相似性有所降低，說明了儲(chǔ)藏時(shí)間的延長對魚丸種菌落組成的相似發(fā)生了變化，這對魚丸中細(xì)菌微生物的菌群組成具有一定的影響。

圖3 屬水平上所有樣本聚類樹與柱狀圖組合分析圖Fig.3 The combined analysischart of clustering tree and histogramfor all samples at genuslevel

2.2.4 樣品的多樣性指數(shù)分析

溱潼魚丸中微生物群落的豐度和多樣性可以由樣本多樣性指數(shù)反映。Coverage代表各樣本文庫覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測的概率越高。由表2結(jié)果可知，所有樣本的覆蓋率均在0.99以上，說明本次測序檢測對樣本中細(xì)菌的覆蓋率很高，測序深度合適，可滿足樣品中細(xì)菌的多樣性分析需要[18]。

表2 各樣品的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of each sample

Ace和Chao1指數(shù)主要反映樣品菌樣豐度，Shannon和Simpson則反映樣品群落多樣性[19]。從A組數(shù)據(jù)可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，A3樣品的Shannon值升高，Simpson值降低，說明其樣品群落的多樣性在增加，經(jīng)過室溫增菌培養(yǎng)后，魚丸中的微生物菌群種類在增加；B組樣品中，在低溫儲(chǔ)藏最初階段，Shannon值較高，Simpson值較低，說明其菌群多樣性較高，但隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，菌樣的多樣性有所降低，其原因可能是低溫作用抑制了部分微生物的生長與繁殖，致使魚丸中微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而其菌樣的豐度增加主要出現(xiàn)在魚丸中的主要腐敗菌。

3 討論與結(jié)論

通過以上試驗(yàn)可以看出，傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離鑒定的方法和高通量測序法雖然都能分析出假單胞菌屬（Pseudomonas）在溱潼魚丸微生物菌群中占有較大比例，但所占比例有一定差異。本試驗(yàn)中，雖然傳統(tǒng)分離法較容易操作，但分離出的微生物種類的數(shù)量遠(yuǎn)低于高通量測序法，且傳統(tǒng)培養(yǎng)方法因?yàn)闃颖緮?shù)量和培養(yǎng)條件的限制，所分離出的菌屬種類不能完全反映出魚丸中微生物菌群的種類及比例，尤其傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離鑒定對于溱潼魚丸儲(chǔ)藏初期比例（豐度）較小的菌屬分離鑒定有一定偏差，而高通量測序法對其中主要微生物菌群及動(dòng)態(tài)變化均能有較為詳細(xì)的呈現(xiàn)。高通量測序除了鑒定出魚丸中絕對優(yōu)勢菌是假單胞菌屬，還揭示了溱潼魚丸中菌群的演替規(guī)律，假單胞菌屬（Pseudomonas）是溱潼魚丸儲(chǔ)藏初期的絕對優(yōu)勢菌屬，除此之外，水棲菌屬（Enhydrobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等也占有一定比例。但隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，至儲(chǔ)藏第7天時(shí)，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）的數(shù)量逐漸占有優(yōu)勢，其與假單胞菌屬（Pseudomonas）均成為冷藏魚丸中的優(yōu)勢菌。這與儀淑敏等[20]通過PCR-DGGE法研究發(fā)現(xiàn)魚糜制品中優(yōu)勢腐敗菌可能是嗜冷桿菌的研究結(jié)果相近。

針對以上結(jié)果推測如果在溱潼魚丸儲(chǔ)藏前期通過對假單胞菌屬（Pseudomonas）進(jìn)行減菌化處理，同時(shí)采取有效措施控制嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）的生長繁殖速度，將有助于改善溱潼魚丸的品質(zhì)，延長其貨架期。