分離自1例慢性阻塞性肺疾病患者的Aspergillus lentulus在蠟螟模型上的毒力初探

謝韻 張麗娟 帕麗達·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830011)

自二十世紀八十年代以來，隨著免疫缺陷患者數(shù)量的增加、病原真菌檢測和鑒定技術(shù)的進步，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升[1]。以往IFI最常見的病原體是酵母菌，特別是念珠菌屬和隱球菌屬。近幾十年來，曲霉已成為IFI的主要病原之一[2]，主要由煙曲霉引起[3]。但是，近年來一些新發(fā)現(xiàn)的曲霉菌也導致嚴重的IFI,這些新發(fā)現(xiàn)的曲霉菌與煙曲霉表型相似，在遺傳和形態(tài)學上難以區(qū)分[4-5]。其中有一種于2005年首次被描述,因其產(chǎn)孢速度慢被命名為A.lentulus[6]。文獻報道[7-9]，至今為止全世界共有19例A.lentulus感染的報道，絕大多數(shù)被感染者是因腫瘤接受化療的免疫功能受損的患者。該菌在48℃不能生長，體外抗真菌藥物敏感試驗發(fā)現(xiàn)其對多個抗真菌藥具有高的MIC(最低抑菌濃度)，尤其是唑類[10-12]。本研究A.lentulus臨床株分離于長期用糖皮質(zhì)激素的慢性阻塞性肺疾病患者痰液，患者被診斷IFI后積極抗真菌治療，但最終死亡。本課題組關(guān)注該菌感染的死亡率高是否與毒力高有關(guān)。文獻復習未發(fā)現(xiàn)關(guān)于A.lentulus的毒力相關(guān)研究，本研究設以大蠟螟為感染模型[13-15]，通過生存時間、組織病理、真菌負載量等綜合評價A.lentulus的毒力。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株Aspergilluslentulus臨床株(編號：XYZ 10198)、A.lentulus標準株(菌號：XYZ 10200)、煙曲霉(菌號：XYZ10186)、白念珠菌(茵號：XYZ9013)來自新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌室。

實驗動物 蠟螟5齡幼蟲125只，平均重量300 mg，長度2.5 cm，顏色呈乳白色無黑點，購自天津惠裕德生物科技有限公司。

實驗試劑 沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)購自美國BD公司；蘇木素-伊紅染液購自華普泰克生物科技有限公司；真菌熒光染色液購自南京漢瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

構(gòu)建蠟螟感染模型 分組：將125只蠟螟隨機分成5組，即煙曲霉組(A.fu)、白念珠菌組(Ca)、A.lentulus臨床組、A.lentulus標準組和PBS組。每組15只觀察生存時間，其余解剖。將上述4組真菌分別接種于SDA上37 ℃培養(yǎng)。其中白念珠菌培養(yǎng)3 d，煙曲霉及A.lentulus培養(yǎng)7 d。用無菌的PBS將各個菌落洗脫，制成相對應1.0×106CFU/mL孢子懸液，蠟螟左下腹尾足處注入40 μL。PBS組注射40 μL無菌PBS作為對照。放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)并制作生存曲線。

制作蠟螟腸道組織病理切片及形態(tài)學觀察 取感染24 h的各組蠟螟幼蟲，在尾足處左下腹注入10%甲醛溶液，4%多聚甲醛溶液浸泡3～7 d，取其腸道組織進行常規(guī)脫水、包埋、切片并進行蘇木素-伊紅(HE)染色。

測定真菌逆培養(yǎng)陽性率及蠟螟腸道真菌載量無菌條件下，將感染的蠟螟腸道組織分成3段接種于SDA試管中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)1周，觀察試管中真菌菌落。同時將蠟螟腸道組織勻漿后，按照倍比稀釋法將蟲體體液稀釋，取100 μL蟲體液均勻涂布在SDA培養(yǎng)基上，于37℃ 培養(yǎng)48 h計數(shù)菌落。

真菌熒光染色各組真菌形態(tài) 將上述SDA試管中真菌菌落，用無菌接種環(huán)刮取少許在載玻片上，將染液均勻滴在菌落上，靜置1 min后熒光顯微鏡下拍攝真菌形態(tài)。

統(tǒng)計學處理 應用Graphpad prism 8.0統(tǒng)計軟件，繪制生存曲線，采用log-rank檢驗；應用SPSS 22軟件，蠟螟腸道真菌載量的比較采用雙因素重復測量方差分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 蠟螟感染各組真菌后的生存情況(見表1、圖1)

表1 各組不同時點蠟螟幼蟲存活數(shù)

圖1 蠟螟在不同時間段的生存率

同一時間點，A.L臨床組與A.L標準組蠟螟幼蟲存活數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Ca組與A.fu組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A.L臨床組與A.L標準組分別與Ca組或A.fu組同一時間點進行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。表中結(jié)論及生存曲線走勢得出，注射A.L臨床組與A.L標準組的蠟螟存活數(shù)比Ca組與A.fu組多。

2.2 病理組織切片結(jié)果(見圖2)

不同菌種感染的蠟螟腸道。A.L臨床組(見圖2A)與A.L標準組(見圖2B)：腸壁結(jié)構(gòu)大致正常，局部可見腸壁水腫，腸腔內(nèi)可見少量淋巴組織細胞； A.fu組(見圖2C)：腸上皮黏膜內(nèi)可見大量淋巴組織細胞及孢子，少量嗜中性粒細胞，未見正常絨毛樣結(jié)構(gòu)； Ca組(見圖2D)：腸壁結(jié)構(gòu)破壞，腸上皮結(jié)構(gòu)紊亂，腸腔內(nèi)可見大量孢子及炎癥細胞浸潤。

圖2 注射不同組真菌蠟螟腸道損傷情況(HE×200).A. 感染A. lentulus臨床株的蠟螟腸道；B. 感染A. lentulus標準株的蠟螟腸道；C. 感染煙曲霉的蠟螟腸道;D. 感染白念珠菌的蠟螟腸道. a. 輕度水腫；b. 孢子及菌絲 圖3 各組真菌逆培養(yǎng)菌落形態(tài). A. A.L臨床組; B. A.L標準組; C. 煙曲霉組; D. 白念珠菌組; E. PBS組

2.3 蠟螟真菌逆培養(yǎng)陽性率及腸道真菌載量

A.L臨床組、A.L標準組、煙曲霉組、白念珠菌組均可見菌落生長，PBS組未見菌落生長(見圖3)。

A.L臨床組和A.L標準組感染蠟螟幼蟲，在24 h內(nèi)各個時間點測得的腸道真菌負載量大致相同(見圖4)。兩組分別與Ca組和A.fu組比較，在各個時間點差異均有統(tǒng)計學意義(見表2，P<0.05)。隨著時間的不斷增加，各組真菌載菌量有不同程度的增加，其中Ca組最為迅速，其次為A.fu組，最后為A.L臨床組和A.L標準組。其中A.L臨床組分別與Ca組、A.fu組，以第12 h和第18 h差異最為明顯。

圖4 蠟螟腸道各時間點真菌負載量曲線

表2 蠟螟腸道組織各時間點真菌負載量

2.4 真菌熒光染色結(jié)果

刮取SDA試管中菌落于載玻片上染上色進行觀察(見圖5)。A.lentulus臨床株、標準株，菌絲較多，孢子較少且發(fā)育緩慢，少見曲霉頭。白念珠菌孢子較多。煙曲霉，孢子多，可見曲霉頭。

圖5 熒光顯微鏡下各真菌形態(tài)(×400). A. A. lentulus臨床株；B. A. lentulus標準株；C. 白念珠菌；D. 煙曲霉. A、B. 菌絲為主；C、D. 孢子為主

3 討 論

小鼠感染模型通常被視為真菌毒力研究的金標準，因經(jīng)濟和倫理的高要求哺乳動物在感染動物實驗中的使用受到了限制，特別是需要做大規(guī)模菌株動物實驗時費用高。鑒于以上問題，微型宿主模型，主要是無脊椎動物，已被探索作為真菌感染的替代模型。這些模型包括阿米巴、線蟲、黑腹果蠅和大蠟螟幼蟲等[16-18]。大蠟螟的幼蟲已被廣泛用于評估微生物病原體的毒力和抗菌藥物療效的替代模型[18-19]。在念珠菌屬[19-20]、曲霉屬[21]、新生隱球菌[22]等致病真菌研究中是被認可的模型動物，蠟螟模型實驗數(shù)據(jù)與小鼠模型實驗數(shù)據(jù)有較強的相關(guān)性[23]。與其他非哺乳動物模型相比，大蠟螟感染模型具有以下優(yōu)勢：價格低廉，不受倫理限制，幼蟲體積較大，能準確注射病原菌接種量，37℃的高溫能存活，相當于哺乳動物宿主的溫度。此外，幼蟲的免疫系統(tǒng)與哺乳動物的先天免疫系統(tǒng)相似，其血細胞采取與人類中性粒細胞相似的機制來識別真菌細胞，主要作用包括病原體識別受體、吞噬作用和氧化爆發(fā)途徑中超氧化物的產(chǎn)生[17,24,25]。不同劑量感染后的蠟螟死亡率或LD50的測定通常被用作評估微生物毒力的主要參數(shù)，并用來對菌株的相對毒力進行排序[17]。在沒有死亡率的情況下，真菌負荷可用于比較菌株之間的毒力[18]。因此，大蠟螟的幼蟲越來越多地被用作微生物感染的模型也就不足為奇了。

A.lentulus感染好發(fā)于接受免疫抑制治療或免疫功能受損的患者，侵襲性曲霉病最常見于呼吸道的感染，患者易發(fā)生播散性曲霉病，并伴有心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腸道和其他器官的受累[26]。本課題組前期對蠟螟幼蟲生存率、體表黑色素化及活動度研究顯示A.lentulus的毒力比煙曲霉和白念珠菌等重要醫(yī)學真菌弱[29]。本研究的毒力實驗使用存活曲線、組織病理學和真菌負載量進一步驗證了以往的研究結(jié)果。用106CFU/mL的不同真菌活化孢子菌懸液感染蠟螟幼蟲，結(jié)果顯示A.lentulus臨床株和標準株毒力比白念珠菌和煙曲霉弱。幼蟲腸道組織損傷在接種前兩者的幼蟲中較不明顯，表現(xiàn)為腸道結(jié)構(gòu)大致正常，局部輕度水腫伴少量菌絲、孢子及炎癥細胞浸潤；后兩者表現(xiàn)為大量炎癥細胞浸潤伴隨真菌孢子堆積，導致腸道組織結(jié)構(gòu)紊亂。與對照菌株相比，A.lentulus臨床株和標準株的低真菌負載量顯示出較低的感染程度。本研究中白念珠菌的真菌負載量比煙曲霉多，可能是因為在一定時間內(nèi)，白念珠菌較煙曲霉生長快，并不代表白念珠菌毒力比煙曲霉強。

真菌毒力的增強或減弱由若干復雜因素決定，如真菌形態(tài)發(fā)生、表面抗原物質(zhì)(β-葡聚糖，幾丁質(zhì)，甘露聚糖等)、黏附因素、色素、細胞因子，次生代謝產(chǎn)物及調(diào)控基因等，因此，真菌毒力研究及致病性被研究者關(guān)注。真菌的毒力和宿主的免疫狀態(tài)共同決定了是否發(fā)生真菌感染以及真菌感染的嚴重程度[15,25,27]。當機體受到外來微生物感染時，便會啟動先天性免疫系統(tǒng)通過其表面的模式識別受體或感應系統(tǒng)激活炎癥反應，促進炎癥因子IL-1β，IL-18 等釋放[28]。本研究初步探究了A.lentulus的毒力,結(jié)果顯示為低毒力菌株，與現(xiàn)存臨床病例報道的高死亡率相矛盾。我們推測造成患者死亡的原因不是該菌的毒力，而是對多種抗真菌藥物不敏感，死亡率高是否與該菌的耐藥基因相關(guān)有待進一步研究。