地木耳乙醇提取物的抑菌機(jī)理及化妝品功效研究

孫 茜，張 赟，湯云峰，劉康欣，陳雪茹，金衛(wèi)華，唐紅楓，3

（1.湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079；2.武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，武漢 430212；3.武漢東湖學(xué)院生物醫(yī)用材料創(chuàng)新研究所，武漢 430212）

地木耳（Nostoc communeVauch）又名地皮菜、天仙米、天仙菜、水木耳、地衣等，屬于藍(lán)藻綱念珠屬植物，是念珠藻中的群體型，藻絲由50～170個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和異形胞組成［1］。地木耳廣泛分布于中國(guó)各地，多生于潮濕的土壤表面和靜水中，夏季雨后濕地上最常見(jiàn)，可固氮，也可食用。地皮菜藻體最初為球形，后生長(zhǎng)為扁平狀，常為有穿孔的膜狀物或革狀物，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的卷曲，形似木耳，在潮濕環(huán)境中呈藍(lán)色、橄欖色；失水干燥后藻體呈黃綠色或黃褐色。地木耳營(yíng)養(yǎng)豐富，其中蛋白質(zhì)、鈣、鐵、磷、維生素等含量很高，具有一定的醫(yī)療保健價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為，地木耳具有降脂明目、補(bǔ)虛益氣、清熱降火等作用［2］。由于地木耳含有海藻糖、鼠李糖、果膠多糖類、葡萄糖苷、胡蘿卜素、藻藍(lán)素以及胞外多糖等多種活性成分，所以地木耳還具有良好的抑菌、抗氧化、保濕、美白等多重功效。目前人們更多青睞的是以植物天然活性成分為原料，對(duì)人體安全無(wú)毒無(wú)副作用的化妝品、護(hù)膚品。因此，研究將從地木耳乙醇提取物抑菌機(jī)理及地木耳化妝品開(kāi)發(fā)和功效測(cè)試進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

地木耳購(gòu)于市場(chǎng)。試驗(yàn)菌種有大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillussabtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）、白色念珠菌（Monilia albican）。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15～20 g）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、水1 000 mL、自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.3 方法

1.3.1 地木耳乙醇提取物的制備 將新鮮的地木耳洗凈，干燥粉碎；料液比1∶50用95%乙醇溶液在40℃條件下提取10 h，抽濾，收集濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 g∕mL左右，用弱堿性樹(shù)脂DEAE纖維素脫色，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。

1.3.2 篩選最佳試驗(yàn)菌種 將保存良好的菌種活化3次，采用抑菌圈法［4］從5種供試菌中篩選最佳試驗(yàn)菌種，最終結(jié)果顯示地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli產(chǎn)生的抑菌圈最大，故后續(xù)試驗(yàn)均采用E.coli作為試驗(yàn)菌種。

1.3.3 最低抑制濃度（MIC）測(cè)定 用LB液體培養(yǎng)基將得到的地木耳乙醇提取物稀釋2、4、8、16、32、64倍，分別向其中等量接種0.1 mLE.coli菌懸液，置于搖床中，37℃、170 r∕min培養(yǎng)過(guò)夜，各濃度分別做3組平行，培養(yǎng)后觀察并判定是否長(zhǎng)菌（其中渾濁表示顯著長(zhǎng)菌，澄清表示未長(zhǎng)菌），確定最低抑制濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）［5］。

1.3.4 抑菌圈法測(cè)定抑菌效果 取50μLE.coli菌懸液涂布于LB固體平板中央。待LB固體平板將菌懸液吸收完全后，在平板中央分別貼上在稀釋倍數(shù)為2、4、8、16、32倍的地木耳乙醇提取物中浸泡1 min的滅菌濾紙片，對(duì)照組貼無(wú)菌水浸泡1 min后的濾紙片。將平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)平行。測(cè)量抑菌圈大小，確定地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli的抑菌能力［4］。

1.3.5 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli生長(zhǎng)曲線的影響 接種大腸桿菌到LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床在37℃、170 r∕min條件下培養(yǎng)，接種2 h后向試驗(yàn)組加入地木耳乙醇提取物（濃度由“1.3.3”的結(jié)果確定），對(duì)照組加等量無(wú)菌水，同時(shí)加入等量等濃度地木耳乙醇提取物于空白培養(yǎng)基以消除地木耳乙醇提取物對(duì)A600nm的影響。每隔一段時(shí)間使用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm時(shí)的吸光度（A600nm），繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.6 上清液電導(dǎo)率的測(cè)定 試驗(yàn)組和對(duì)照組操作同“1.3.5”。每隔一段時(shí)間取菌懸液離心后的上清液測(cè)定電導(dǎo)率，制成電導(dǎo)率的變化曲線，確定地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli電導(dǎo)率的影響。

1.3.7 上清液可溶性總糖的測(cè)定 試驗(yàn)組和對(duì)照組操作同“1.3.5”。每隔一段時(shí)間取菌懸液離心，采用苯酚-硫酸法［6］測(cè)其上清液可溶性總糖濃度，繪制上清液可溶性總糖濃度變化曲線，確定地木耳乙醇提取物中抑菌物質(zhì)對(duì)菌懸液總糖含量的影響。

1.3.8 上清液總蛋白質(zhì)的測(cè)定 試驗(yàn)組和對(duì)照組操作同“1.3.5”。每隔一段時(shí)間取菌懸液離心，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［7］測(cè)其上清液蛋白質(zhì)含量，繪制上清液總蛋白質(zhì)濃度變化曲線，確定地木耳乙醇提取物中抑菌物質(zhì)對(duì)菌懸液總蛋白質(zhì)含量的影響。

1.3.9 地木耳化妝品的制備

1）地木耳保濕精華水的制備。原料組分按重量份數(shù)計(jì)為地木耳乙醇提取物4.0～8.0，甘油9.0～12.0，十六醇6.5～9.0，白油0.5～1.0，三乙醇胺0.5～0.8，羊毛脂0.1～0.2，尼泊金丙酯0.1～0.15，去離子水90～100，香精0.1～0.3。將甘油和去離子水恒溫水浴加熱至85℃左右，再向其中加入十六醇、白油、三乙醇胺和羊毛脂，加熱并攪拌至完全熔化。過(guò)濾并滅菌。溶液降至65℃左右時(shí)加入地木耳乙醇提取物和香精。溫度降至45℃時(shí)加入尼泊金丙酯，攪拌均勻后靜置，即得所需化妝品。

2）地木耳護(hù)膚霜的制備。原料組分按重量份數(shù)計(jì)為地木耳乙醇提取物4.0～8.0，去離子水70～80，甘油6.5～10，十六醇5.0～7.5，白油3.0～4.0，硬脂酸4.5～6.5，羊毛脂1.0～2.0，三乙醇胺0.3～0.6，香精0.1～0.3，尼泊金丙酯0.1～0.15。將硬脂酸、白油、羊毛脂、三乙醇胺和十六醇置于燒杯中，80～90℃水浴加熱并攪拌至完全熔化，然后加入去離子水和甘油，充分?jǐn)嚢韬笥?5℃左右保溫20 min。過(guò)濾并滅菌。于溫度降至65℃左右時(shí)加入地木耳乙醇提取物和香精。溫度降至45℃左右時(shí)再加入尼泊金丙酯，攪拌均勻后靜置，即得到所需化妝品。

3）地木耳濕紙巾型面膜的制備。原料組分按重量份數(shù)計(jì)為地木耳乙醇提取物8.0～10.0，甘油6.0～7.0，十六醇5.5～7.0，羊毛脂2.5～3.0，白油0.5～1.0，無(wú)水乙醇2.0～3.0，三乙醇胺0.5～0.6，去離子水100～110，尼泊金丙酯0.1～0.15，香精0.1～0.3。將羊毛脂、十六醇、白油三乙醇胺在80～90℃下加熱攪拌至完全熔化，然后加入去離子水和甘油，45℃水浴保溫20 min。過(guò)濾并滅菌。于溫度降至65℃左右時(shí)加入地木耳乙醇提取物和香精，繼續(xù)攪拌并加入尼泊金丙酯和無(wú)水乙醇，靜置，得到面膜液。將潔凈無(wú)菌的市售面膜紙浸潤(rùn)于面膜液中，即得到所需化妝品［8，9］。

1.3.10 地木耳化妝品的性能測(cè)試

1）地木耳化妝品感官測(cè)試及pH測(cè)試。直接用目測(cè)法觀察化妝品色澤、氣味及膏體黏稠度、涂展性等性質(zhì)；使用pH計(jì)測(cè)定pH。

2）地木耳化妝品穩(wěn)定性測(cè)試。各取2份5 mL地木耳保濕精華水、5 g地木耳滋潤(rùn)霜、5 mL面膜液。

耐熱試驗(yàn)：將3種化妝品中的試驗(yàn)組樣品置于40℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，保溫24 h后取出，恢復(fù)室溫后與置于室溫下24 h的對(duì)照組樣品進(jìn)行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層及硬度變化等現(xiàn)象發(fā)生。

耐寒試驗(yàn)：將3種化妝品中的試驗(yàn)組樣品置于-20℃電冰箱內(nèi)，保持24 h后取出，待樣品恢復(fù)室溫后與置于室溫下24 h的對(duì)照組樣品進(jìn)行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層及硬度變化等現(xiàn)象發(fā)生。

冷熱交替循環(huán)試驗(yàn)：將3種化妝品中的試驗(yàn)組樣品置于40℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，取出在室溫下放置24 h，再置于-20℃冰箱中冷凍24 h。此步驟循環(huán)3次，最后與另1份置于室溫下的對(duì)照組樣品進(jìn)行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層及硬度變化等現(xiàn)象發(fā)生。

離心試驗(yàn)：將3種化妝品中的試驗(yàn)組樣品置于離心機(jī)中，2 000～4 000 r∕min離心30 min后，取出與另1份置于室溫下的對(duì)照組樣品進(jìn)行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層等現(xiàn)象發(fā)生［10］。

3）地木耳化妝品安全性測(cè)試——斑貼試驗(yàn)。選擇18～60歲符合試驗(yàn)要求的健康志愿者30名作為受試對(duì)象。選用市售合格斑試材料，將受試化妝品樣品放入斑試器內(nèi)，固體用量為0.03 g，液體用量為0.03 mL?？瞻讓?duì)照孔不添加任何物質(zhì)。將斑試器（加有受試化妝品樣品）貼敷于受試者受試區(qū)域（前臂曲側(cè)或背部）保持24 h。除去斑試器后，分別間隔30 min、24 h、48 h觀察受試者皮膚反應(yīng)［11］。

4）美白功效測(cè)試——酪氨酸酶抑制測(cè)試。黑色素合成途徑中的重要限速酶是酪氨酸酶，該酶通過(guò)影響酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴，多巴氧化為多巴醌來(lái)影響黑色素的生成［12］。參照文獻(xiàn)［13，14］，通過(guò)測(cè)定化妝品對(duì)酪氨酸酶的抑制作用來(lái)測(cè)試其美白功效。

5）保濕功效測(cè)試。健康的皮膚角質(zhì)層應(yīng)水分充足，皮膚水分充足可以增強(qiáng)皮膚彈性，減少皺紋生成和色素沉著。選好受試部位（所有志愿者受試部位相同）并做好標(biāo)記。直接使用皮膚含水量測(cè)定儀測(cè)量標(biāo)記區(qū)域的含水量，記錄數(shù)據(jù)。前3塊區(qū)域分別涂抹保濕水、護(hù)膚霜、面膜液［（2.0±0.1）mg∕cm2］，第4塊區(qū)域?yàn)榭瞻讓?duì)照。10 min后使用皮膚含水量測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)區(qū)域依照平行測(cè)定3次（時(shí)間分別為涂抹前、涂抹后10 min、涂抹后1 h），記錄數(shù)據(jù)［15-17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑制濃度（MIC）的確定

由表1可知，當(dāng)稀釋倍數(shù)在8倍及以下時(shí)，均未長(zhǎng)菌，說(shuō)明稀釋8倍及以下時(shí)均有明顯的抑菌作用。故可確定地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli的最低抑制濃度（MIC）為8倍，即藥物濃度為0.25 g∕mL。此結(jié)果為后續(xù)測(cè)定培養(yǎng)液電導(dǎo)率、總糖、可溶性蛋白質(zhì)提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

表1 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli的最低抑制濃度試驗(yàn)

2.2 抑菌圈試驗(yàn)測(cè)定地木耳乙醇提取物的抑菌能力

由表2可知，當(dāng)?shù)啬径掖继崛∥锵♂?倍及以內(nèi)時(shí)均出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，且在稀釋倍數(shù)為2、4、8倍時(shí)，抑菌圈直徑呈直線下降，說(shuō)明濾紙片中的抑菌物質(zhì)與稀釋濃度呈正相關(guān)。當(dāng)稀釋倍數(shù)為16倍時(shí)，有2組試驗(yàn)中未出現(xiàn)抑菌圈，表明在該稀釋倍數(shù)下濾紙片中的抑菌物質(zhì)的含量不足以抑制E.coli的生長(zhǎng)和繁殖。此結(jié)果可與最低抑制濃度（MIC）的測(cè)定試驗(yàn)相互印證。

表2 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli的抑菌圈直徑

2.3 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli生長(zhǎng)曲線的影響

E.coli在接種2 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli菌體活性較高。較高的代謝水平有利于抑菌物質(zhì)及時(shí)作用于菌體，故選定在接種2 h后向LB液體培養(yǎng)基中加入地木耳乙醇提取物，以測(cè)試各項(xiàng)指標(biāo)，研究地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli的抑菌機(jī)理。

由圖1可知，當(dāng)向菌懸液中加入地木耳乙醇提取物后（2 h），試驗(yàn)組E.coli繁殖基本停止，地木耳乙醇提取物加入2 h內(nèi)有部分菌體死亡導(dǎo)致菌懸液濃度降低，即地木耳乙醇提取物可影響E.coli的正常生長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)照組E.coli生長(zhǎng)狀態(tài)良好，繁殖速度快，進(jìn)一步證明試驗(yàn)組E.coli的生長(zhǎng)停滯是由此試驗(yàn)的惟一變量因素導(dǎo)致的。

圖1 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli生長(zhǎng)的影響

2.4 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli液體培養(yǎng)基上清液電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞膜能維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中大量電解質(zhì)將進(jìn)入到液體培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基的電導(dǎo)率上升。此時(shí)，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物上清液電導(dǎo)率來(lái)反映細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的變化情況［18-20］。

由圖2可知，當(dāng)向菌懸液中加入地木耳乙醇提取物后，LB液體培養(yǎng)基上清液電導(dǎo)率開(kāi)始升高，且隨著地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli作用時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)升高，這說(shuō)明加入地木耳乙醇提取物后E.coli細(xì)胞膜被破壞而發(fā)生胞質(zhì)滲漏，且發(fā)生胞質(zhì)滲漏的速度不斷加快。加入地木耳乙醇提取物4 h后，試驗(yàn)組上清液的電導(dǎo)率達(dá)到最大值，說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)導(dǎo)致大部分菌體細(xì)胞破損，地木耳乙醇提取物能在短時(shí)間內(nèi)破壞E.coli細(xì)胞壁，達(dá)到抑菌的目的。

圖2 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli培養(yǎng)液電導(dǎo)率影響

2.5 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli液體培養(yǎng)基上清液可溶性總糖含量的影響

E.coli會(huì)儲(chǔ)備糖類作為能源儲(chǔ)備物質(zhì)，當(dāng)其膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)（如糖類等）會(huì)進(jìn)入培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中可溶性總糖濃度上升?？赏ㄟ^(guò)觀測(cè)培養(yǎng)物上清液中可溶性總糖濃度的變化，間接反映細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的完整性［21，22］。

由圖3可知，在加入地木耳乙醇提取物之后，E.coli培養(yǎng)物上清液中的可溶性總糖濃度開(kāi)始升高，說(shuō)明加入地木耳乙醇提取物后部分細(xì)胞開(kāi)始滲漏出糖類進(jìn)入培養(yǎng)基。在加入地木耳乙醇提取物4 h左右，E.coli培養(yǎng)物上清液中可溶性總糖濃度達(dá)到最大值，說(shuō)明此時(shí)大部分E.coli細(xì)胞膜遭到破壞，菌體內(nèi)容物逐漸滲漏到胞外。同時(shí)對(duì)照組培養(yǎng)物中可溶性總糖濃度因E.coli的正常生長(zhǎng)繁殖消耗而逐漸降低。此結(jié)果與上述試驗(yàn)中電導(dǎo)率的結(jié)果一致。

圖3 地木耳乙醇提取物處理后E.coli培養(yǎng)液中可溶性總糖含量的變化

2.6 地木耳乙醇提取物對(duì)E.coli液體培養(yǎng)基上清液蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可知，在加入地木耳乙醇提取物后，E.coli培養(yǎng)物上清液中的可溶性蛋白質(zhì)含量開(kāi)始顯著升高，說(shuō)明加入地木耳乙醇提取物導(dǎo)致部分細(xì)胞的細(xì)胞膜遭到破壞從而使蛋白質(zhì)流出［23］。同時(shí)對(duì)照組因?yàn)镋.coli的正常生長(zhǎng)繁殖消耗導(dǎo)致培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量有所降低。

圖4 地木耳乙醇提取物處理后E.coli培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量的變化

2.7 地木耳化妝品的性質(zhì)測(cè)試

2.7.1 感官測(cè)試及pH的測(cè)定結(jié)果 通過(guò)對(duì)地木耳化妝品的感官測(cè)試和pH測(cè)定，發(fā)現(xiàn)制備的化妝品均符合國(guó)家化妝品標(biāo)準(zhǔn)，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 感官測(cè)試及p H的測(cè)定結(jié)果

2.7.2 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果 通過(guò)穩(wěn)定性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)制備的化妝品的穩(wěn)定性均表現(xiàn)良好，在改變溫度以及離心的條件下，其性能均可保持穩(wěn)定（表4）。

表4 地木耳化妝品的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.7.3 安全性測(cè)試結(jié)果 斑貼試驗(yàn)結(jié)果表明，未出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、水皰等不良反應(yīng)，也未出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。在使用地木耳化妝品時(shí)，覺(jué)得涂抹部位滋潤(rùn)清涼舒適。由此可以初步判斷地木耳化妝品對(duì)人體皮膚沒(méi)有危害，無(wú)毒副作用。

2.7.4 地木耳化妝品功效測(cè)試

1）美白功效。從測(cè)試結(jié)果來(lái)看，地木耳化妝品對(duì)酪氨酸酶活性均有一定抑制作用，其中地木耳濕紙巾型面膜對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最好（圖5）。若長(zhǎng)期使用此類護(hù)膚品可以達(dá)到一定的美白效果。

2）保濕功效。由表5可知，每個(gè)地木耳化妝品涂敷的部分含水量遠(yuǎn)高于空白對(duì)照部分，說(shuō)明地木耳化妝品能有效補(bǔ)充皮膚流失的水分，保持肌膚彈性。涂敷1 h后，試驗(yàn)組皮膚含水量仍高于空白對(duì)照組，可使皮膚長(zhǎng)期處于水分充足的狀態(tài)，預(yù)防皮膚皸裂。

表5 保濕試驗(yàn)結(jié)果 （單位：%）

3 結(jié)論

地木耳乙醇提取物有良好的抑菌性，對(duì)E.coli的最低抑制濃度（MIC）為0.25 g∕mL。E.coli在經(jīng)過(guò)地木耳乙醇提取物處理后會(huì)發(fā)生胞質(zhì)滲漏，發(fā)揮作用速度較快，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)胞質(zhì)滲漏現(xiàn)象越來(lái)越明顯，在加入地木耳乙醇提取物4 h后大部分菌體細(xì)胞膜破損，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到抑菌的目的。

所制備的地木耳化妝品的感官評(píng)價(jià)和pH均符合國(guó)家化妝品標(biāo)準(zhǔn)，并在改變溫度和離心的情況下均表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。

地木耳化妝品對(duì)皮膚無(wú)刺激也無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，安全無(wú)毒副作用，其對(duì)酪氨酸酶也具有一定的抑制作用，還能提高皮膚含水量且失水率小，體現(xiàn)了其美白功效和保濕功效。

地木耳是一種含有多種營(yíng)養(yǎng)成分并具有良好抑菌效果的天然植物，有較高的藥用價(jià)值。地木耳化妝品具有滋潤(rùn)、美白、保濕等多重護(hù)膚功效。如今，人們?cè)絹?lái)越青睞于綠色環(huán)保、天然健康的化妝品［24］，地木耳化妝品很符合人們的需求。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，地木耳活性成分提取方式簡(jiǎn)單，易于掌握，未來(lái)在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。