恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂)體內(nèi)的代謝及消除規(guī)律

戴燕彬

(漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 漳州 363000)

珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatus♂)，又稱龍虎斑、珍珠斑，是由雄性鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)和雌性棕點石斑魚(E.fuscoguttatus)雜交得到的新品種。珍珠龍膽石斑魚結(jié)合了父本生長速度快和母本抗病力強等優(yōu)點，具有明顯的雜種優(yōu)勢，其肉質(zhì)鮮嫩，蛋白質(zhì)、脂肪及不飽和脂肪酸含量高[1]，適應(yīng)環(huán)境能力強，目前其已成為漳州市石斑魚主要的養(yǎng)殖品種之一。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷加大、養(yǎng)殖密度劇增，各種病害問題逐漸凸現(xiàn)，其中弧菌病(Vibriosis)是對石斑魚養(yǎng)殖危害較為嚴(yán)重的細菌性疾病之一，常造成養(yǎng)殖石斑魚大量死亡[2]。目前已報道的珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖中的弧菌病原有哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)[3-4]、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[5]等，這些弧菌對珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前針對弧菌感染危害，常使用抗菌藥進行防治[6-7]。恩諾沙星(Enrofloxacin)是人工合成的第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥，因具有高效廣譜、毒副作用小、與其他常用抗菌藥物無交叉耐藥性，且對革蘭氏陰性菌、陽性菌、支原體等都有抑制或殺菌效果，尤其對革蘭氏陰性菌作用更強等特點，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物細菌性疾病和支原體感染的治療[8-11]。但在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，由于缺乏科學(xué)的理論指導(dǎo)，在使用抗菌藥物時普遍存在藥物濫用的現(xiàn)象，加之各養(yǎng)殖品種對藥物的代謝能力差異較大，導(dǎo)致藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留超標(biāo)現(xiàn)象時有發(fā)生。因此，恩諾沙星在動物體內(nèi)代謝和消除的研究也備受關(guān)注。目前，國內(nèi)已在大黃魚(Larimichthyscrocea)[12-13]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguill)[14]、方正銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[15]、斑點叉尾魚回(Ictaluruspunctatus)[16]、俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)[17]等多種魚類中開展恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)藥代動力學(xué)和殘留情況研究，但有關(guān)恩諾沙星及環(huán)丙沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的代謝及殘留情況尚未見報道。

本研究以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，研究恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的代謝殘留規(guī)律，提出珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖過程中恩諾沙星的休藥期建議，為指導(dǎo)珍珠龍膽石斑魚健康養(yǎng)殖和保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚

實驗所用的健康珍珠龍膽石斑魚由福建省水產(chǎn)研究所小嶝島實驗基地提供，平均體重為(300±28)g。實驗開始前先將珍珠龍膽石斑魚在養(yǎng)殖池內(nèi)暫養(yǎng)15 d，并隨機抽取5尾珍珠龍膽石斑魚分別進行血漿、肝臟和肌肉檢測，以確認無恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留。實驗過程中使用人工配合飼料進行飼喂，且經(jīng)過檢測確定均不含恩諾沙星和環(huán)丙沙星。在整個實驗過程中，利用加熱棒進行輔助調(diào)節(jié)，使養(yǎng)殖水溫控制在28℃，養(yǎng)殖用水為砂濾海水；養(yǎng)殖池為圓形，中間排污，配備相應(yīng)的進水、排水、增氧等設(shè)施；每日記錄培育水池水體溫度、溶解氧、pH值等理化指標(biāo)，觀察魚的活動情況和生長攝食情況。

1.1.2 主要儀器

高效液相色譜質(zhì)譜儀(Agilent 6410，安捷倫)；電子天平(BS223S，北京賽多利斯)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52，上海亞龍生化儀器廠)；低速離心機(XLJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠)；高速離心機(TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)；漩渦混合器(XK80-A，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)。

1.1.3 主要試劑

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.90%，CAS號：93106-60-6，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%，CAS號：85721-33-1，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)，甲醇、乙腈、正己烷、乙酸銨(色譜純，德國Merck公司)，甲酸(色譜純，Tedia 公司)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式

參照大黃魚[13]、鱘魚[18]、鲆鰈魚[19]等魚類的給藥方式和劑量，本研究按照30 mg/(kg·bw)劑量進行口灌給藥，根據(jù)石斑魚體重計算所需注入的藥液量，連續(xù)口灌給藥5 d。口灌給藥方式：按住幼魚鰓蓋下方，使其開口，將注射器伸入魚口中，將管口沿魚的口腔壁深入到魚的胃腸道，將伴有適量淀粉和少許紅色食用色素的恩諾沙星送入到魚的胃腸道。灌藥完畢后，選擇不回吐(紅色食用色素作為回吐指示劑)的石斑魚用于實驗。

1.2.2 樣品采集

從開始口灌給藥后開始采集樣品。采集點分別為每天給藥后3 h，最后一次口灌給藥后3、6、12、24、48、96 h以及6 、8 、12 、16 、20 、25 、30 、35 、40 、50 、60 和70 d，每次采樣5尾，分別采集血漿、肝臟和肌肉(放入-20℃冰箱保存)。

血漿樣品采集：抄網(wǎng)撈起石斑魚，用干凈整潔的紗布將魚體擦干。采取斷尾采血5 mL置于預(yù)先用1%肝素鈉溶液處理過的50 mL離心管中，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液于-20℃冰箱保存。

肝臟取樣：用75%酒精進行魚體表消毒，切開魚腹表面的中線，然后水平方向切開魚的腹壁，取出所有消化器官(包括胃腸道、肝臟、膽囊、脾臟、脂肪)，將肝臟完整剝離，放入封口袋，置于-20℃冰箱保存。

肌肉取樣：魚體表消毒后，用鋒利刀片剝離魚皮，剪取魚體背鰭肌肉樣品，每尾魚肌肉取樣20 g，放入封口袋，置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品或1 mL血漿于50 mL離心管內(nèi)，加入1%甲酸-乙腈溶液(V/V) 20 mL，高速均質(zhì)(渦旋混合)30 s后離心，取上清液于分液漏斗中，用20 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液，加入25 mL乙腈飽和正己烷，搖勻，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)移到雞心瓶中，40℃水浴中減壓濃縮至干，再加入2 mL乙腈水(1+9)(0.1%甲酸)溶液洗脫，過濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.4 樣品檢測

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測樣品中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的含量。高效液相色譜條件：色譜柱為XBridge BEH C18柱，50 mm×2.1 mm，柱溫35℃；粒徑2.5 μm；流動相A為乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L，0.1%甲酸)，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速為0.3 mL/min；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：離子化模式(Iron source)為大氣壓噴霧電離源(ESI)，正離子模式(350℃)；輔助器壓力：35 psi；噴霧電壓(Capillary)為 4 kV；裂解電壓(Fragmentor)：135 V；霧化氣流量(Gas flow)：11 L/min。離子碎片及內(nèi)標(biāo)物信息如表2。

表2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用DAS 2.0中智能化分析進行藥動學(xué)分析，采用Microsoft Excel 2010 進行記錄，分析藥物濃度與時間的關(guān)系，并繪制曲線。

2 結(jié)果

2.1 分析方法驗證

在本實驗的條件下，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟三種組織中的檢測限均為1.0 μg/kg，在加標(biāo)水平2～100 μg/L時，平均回收率為85.6%～120%；恩諾沙星和環(huán)丙沙星在質(zhì)量濃度0～800 μg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.997和0.999，線性關(guān)系良好。

2.2 恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的代謝及殘留消除情況

2.2.1 恩諾沙星的代謝及殘留消除情況

口灌給藥后，恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的含量變化如圖1所示。給藥后，血漿、肝臟、肌肉中恩諾沙星濃度隨即迅速升高。在第4天給藥后3 h，肌肉濃度達到峰值，達峰濃度為8.20 mg/kg，在達峰后的24 h內(nèi)肌肉中恩諾沙星濃度迅速下降，濃度從8.20 mg/kg下降到2.97 mg/kg，隨后持續(xù)下降但速度變緩；血漿、肝臟達峰時間為第5天給藥后3 h；達峰濃度以血漿最高，為24.5 mg/L，其次是肝臟，為13.0 mg/kg。血漿、肝臟中的恩諾沙星濃度在第5天給藥結(jié)束后的3～48 h內(nèi)快速下降，濃度分別從24.5 mg/L、13.0 mg/kg下降到5.12 mg/L、1.26 mg/kg，隨后下降速度緩慢。恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)殘留時間較長，其在給藥結(jié)束后的第70 天血漿、肝臟、肌肉中仍可被檢出，含量分別為0.128mg/L、0.009 30mg/kg、0.026 1mg/kg。

2.2.2 環(huán)丙沙星的代謝及殘留消除情況

口灌恩諾沙星后，其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的含量變化如圖2所示。給藥后3 h，在血漿、肝臟、肌肉中均有檢出環(huán)丙沙星，之后其含量快速上升，直至達到最大值，其中肝臟中濃度最高。環(huán)丙沙星在肌肉中的達峰時間最早，為第4天給藥后3 h，達峰濃度為0.110 mg/kg，肝臟、血漿中的達峰時間為第5天結(jié)束給藥后3 h，達峰濃度分別為0.738 mg/L、0.276 mg/kg，遠低于相應(yīng)組織中恩諾沙星的濃度。直至給藥結(jié)束后的第35 天，肌肉中的環(huán)丙沙星不再檢出。

2.3 恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)

在28℃的水溫條件下，以30 mg/(kg·bw)恩諾沙星對珍珠龍膽石斑魚進行連續(xù)5 d口灌給藥，采用DAS 2.0藥代動力學(xué)軟件對珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)恩諾沙星濃度-時間數(shù)據(jù)進行分析擬合，結(jié)果顯示恩諾沙星在血漿、肝臟和肌肉中的藥物代謝動力學(xué)模型符合二室模型，藥代動力學(xué)參數(shù)如表3所示。

表3 口灌給藥后恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)

續(xù)表3

3 討論

藥峰濃度(Cmax)是反映藥物在體內(nèi)吸收速率和吸收程度的重要指標(biāo)，達峰時間(Tmax)能夠反映藥物吸收的快慢，吸收速度快則達峰時間短[20]。常志強等[19]以10 mg/kg劑量的恩諾沙星分別給大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)和半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)連續(xù)灌胃給藥3 d，血漿、肌肉、肝臟中的達峰時間均為給藥后1 d，3個品種血漿中的藥峰濃度分別為(6.14±0.50)μg/mL、(5.97±0.95)μg/mL、(3.67±1.12)μg/mL；肌肉中的藥峰濃度分別為(10.21±2.20)μg/mL、(7.77±3.21)μg/mL、(5.99±0.81)μg/mL；在肝臟中的藥峰濃度分別為(9.33±1.87)μg/mL、(6.49±1.40)μg/mL、(4.77±1.33)μg/mL。趙鳳等[21]以10 mg/kg 恩諾沙星劑量口灌給藥西伯利亞鱘的研究表明，恩諾沙星在血漿、肝臟和肌肉中的達峰時間(Tmax)分別為0.5、0.9和1.23 h；峰濃度值(Cmax)分別為0.329、4.162和3.350 mg/L。張?zhí)炻刐13]利用藥餌投喂方式研究恩諾沙星在大黃魚血漿、肝臟和肌肉組織中的殘留，結(jié)果表明恩諾沙星在3個組織中的殘留較快便可達到峰值，達峰時間分別為給藥后8、12和12 h，濃度分別為3.068、3.446和 4.089 mg/kg。本研究中恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟中的達峰時間不一致，其中在肌肉中的達峰時間最短，為第4天給藥后3 h，血漿和肝臟達峰時間均為第5天給藥后3 h，其達峰濃度分別為8.20 mg/kg、24.5 mg/L和13.0 mg/kg，說明各組織對恩諾沙星的吸收速度不一致，肌肉的吸收速度快于血漿和肝臟，且在血漿和肝臟的達峰濃度明顯高于上述幾種魚類。由此可見，恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的吸收速度快且吸收程度高。

目前多數(shù)研究認為，恩諾沙星進入水生動物機體后，98%恩諾沙星以原藥形式存在，脫乙基后產(chǎn)生的環(huán)丙沙星是其在水生動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物[22]。在本研究中，血漿、肝臟、肌肉中恩諾沙星和其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的峰濃度差異性很大，恩諾沙星在血漿、肝臟、肌肉中的達峰濃度大小依次是血漿>肝臟>肌肉，分別為24.5 mg/L、13.0 mg/kg 、8.20 mg/kg，但是環(huán)丙沙星在血漿、肝臟、肌肉中的達峰濃度大小依次是肝臟>血漿>肌肉，峰值分別為0.738 mg/kg、0.276 mg/L、0.110 mg/kg，且在口灌給藥后，肝臟中環(huán)丙沙星在每個取樣時間點的含量均高于肌肉和血漿，這與中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肌注恩諾沙星[23]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[24]肌注恩諾沙星、牙鲆[25]和西伯利亞鱘[21]口灌恩諾沙星的研究結(jié)果一致，這可能是因為藥物要產(chǎn)生藥效須先經(jīng)吸收進入血漿，并隨血漿分布到機體各組織中，藥物在肝臟組織中發(fā)生代謝產(chǎn)生環(huán)丙沙星，而肝臟富含藥物Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝所需的各種酶，因此藥物進入體內(nèi)后主要在肝臟進行生物轉(zhuǎn)化[20]。

恩諾沙星的代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星同樣具有抗菌活性，且作用迅速、殺菌效果好[25]。因此，恩諾沙星的最大特點是其原藥及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在動物體內(nèi)共同發(fā)揮作用，抗菌力強[26-27]。Larsen R等[28]的研究表明，恩諾沙星的最低抑菌濃度(MIC)為0.016～8.0 μg/mL，而對于一些革蘭氏陰性菌及葡萄球菌、鏈球菌等革蘭氏陽性菌的(MIC)小于1.0 μg/mL；David M J等[29]則報道了恩諾沙星對800株不同細菌的MIC，對大多數(shù)革蘭氏陰性菌的MIC平均值一般不超過0.25 μg/mL?，F(xiàn)有研究表明，抗菌藥物給藥劑量是否有效取決于血漿中藥物的峰濃度(Cmax)與MIC比值能否達到10，當(dāng)比值大于10時即可起到良好的治療效果[30]。本研究結(jié)果顯示，血漿中恩諾沙星Cmax為24.5 mg/L，環(huán)丙沙星Cmax為0.276 mg/L，Cmax/MIC值大于10，表明以30 mg/(kg·bw)劑量連續(xù)5 d灌胃給藥對革蘭氏陰性菌的病原治療是有效的。

消除半衰期(T1/2β)是反映藥物從體內(nèi)消除速度的一個重要參數(shù)[20]。本研究結(jié)果顯示，恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚血漿、肝臟和肌肉中的消除半衰期分別為69.315、19.704和69.315 h，其在肝臟中的消除速度最快。恩諾沙星在歐洲鰻鱺[14]的血漿、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為908.07、901.24和59.32 h，在牙鲆[25]血液、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為157.989、67.759和211.732 h，在方正銀鯽[15]的血液、肝臟和肌肉中的消除半衰期分別為93.303、211.913和156.415 h，這表明恩諾沙星在不同魚體內(nèi)消除的快慢程度存在較大的差異。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)[31]規(guī)定，恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在魚的皮和肉中的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg，而環(huán)丙沙星在我國現(xiàn)行的《無公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則》(NY 5071—2002)中被列為禁用藥物。本研究中，以肌肉作為靶組織，在休藥第30天時，肌肉中的恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物的殘留量分別為0.075 4、0.001 0 mg/kg，低于MRL；在休藥第35天時，肌肉中的恩諾沙星殘留量為0.059 0 mg/kg，且其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星開始低于檢出限。因此，在28℃條件下，以30 mg/(kg·bw)劑量對珍珠龍膽石斑魚口灌給藥5 d，建議休藥期不得低于35 d，即980度日。

4 結(jié)論

本研究以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，研究恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)的代謝及殘留消除情況。恩諾沙星在珍珠龍膽石斑魚血漿、肝臟、肌肉中峰值的大小依次是血漿>肝臟>肌肉；在血漿、肌肉中的消除半衰期最長，均為69.315 h；建議在28℃的水溫條件下，以30 mg/(kg·bw)劑量連續(xù)5 d灌胃給藥，休藥期不得低于980度日。