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    紅毛藻多糖的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

    2021-06-29 05:57:44吳云輝閻光宇張怡評晉文慧
    漁業(yè)研究 2021年3期
    關(guān)鍵詞:紅毛羥基清除率

    吳云輝,閻光宇,余 蕾,張怡評,楊 婷,晉文慧

    (1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院,海洋生物學(xué)院,福建 廈門 361100; 2.自然資源部第三海洋研究所,海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心,福建 廈門 361005; 3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建 廈門 361005)

    紅毛藻(Bangiafusco-purpurea)俗稱紅發(fā)菜、牛毛藻、牛毛海苔,屬紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Florideophyceae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紅毛菜屬(Bangiaatropurpurea)植物。紅毛藻主產(chǎn)于莆田湄洲、南日島一帶海域,顏色褐紅,細如毛發(fā),含有豐富的鈣質(zhì)和各種維生素,年產(chǎn)量約為80~100 t(干重)。目前主要作為食品原料銷售,每噸紅毛藻的價格為(10~30)×104元,然而,關(guān)于紅毛藻精深加工產(chǎn)品尚未見到[1]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)紅毛藻中含有豐富的多糖類成分,這種成分具有降血壓、降血脂、防止動脈粥樣硬化等多種生物活性[1-2]。海藻多糖的提取及活性研究一直是藻類資源研究與開發(fā)的熱點,但由于紅毛藻價格較高,關(guān)于紅毛藻多糖的提取工藝及開發(fā)應(yīng)用的研究報道較少。本文對紅毛藻多糖提取工藝中的料液比、溫度、時間三個因素進行單因素實驗考察,并通過正交實驗優(yōu)選最佳提取工藝,試制樣品,而后對其體外抗氧化活性進行評價,以期為紅毛藻多糖的進一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    干紅毛藻,購自福建莆田南日鎮(zhèn)。

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),分析純,Sigma公司;葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、水楊酸、雙氧水、七水硫酸亞鐵等試劑均為分析純,中國醫(yī)藥集團。

    1.2 儀器

    UH5300紫外-可見分光光度計,日本HITACHI公司;H1650-V離心機,湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司;SQP電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;QL-901漩渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;HH-ZK2恒溫水浴鍋,鞏義市予華儀器有限公司;DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;DFT-200粉碎機,溫嶺市林大機械有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 多糖含量測定方法

    精密稱量葡萄糖,用水配制成0.1 mg/mL標準溶液,分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液置于20 mL具塞試管,加水至1.0 mL,配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL系列葡萄糖標準溶液,再依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/W)和5 mL濃硫酸,每個樣品加水補足至總體積10 mL,渦旋混勻后于30℃水浴反應(yīng)20 min,之后在 490 nm 測定吸光度[2],以吸光度為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

    1.3.2 紅毛藻多糖提取

    將干燥的紅毛藻用粉碎機粉碎,過篩(40目)。稱取紅毛藻粉末1.0 g,置于100 mL三角燒瓶中,按照料液比1∶40(W/V)加入40 mL蒸餾水后,于80℃水浴加熱提取2.0 h,紗布過濾,離心取上清液,量取濾液體積并測定吸光度以計算紅毛藻多糖提取量。

    1.3.3 提取液中多糖含量的測定

    取紅毛藻多糖提取液0.5 mL,按照1.3.1方法依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/V)和5 mL濃硫酸,加水補足至10 mL,渦旋混勻,于30℃水浴反應(yīng)20 min后,在490 nm 測定吸光度[3],代入葡萄糖標準曲線,求算提取液濃度,并計算提取液中紅毛藻多糖提取量。

    多糖提取量(mg/g)=M1×V1/M2

    (1)

    式(1)中,M1:從標準曲線上計算出樣品溶液的含量(mg/mL);M2:取樣量(g);V1:樣品定容體積(mL)。

    1.3.4 紅毛藻多糖提取單因素實驗

    以料液比、提取溫度、提取時間作為考察因素,以紅毛藻多糖提取量為指標進行單因素實驗。

    1)考察料液比對紅毛藻多糖提取量的影響

    精密稱取1.0 g紅毛藻粉末12份,每個條件平行3份,按照料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V),分別依次加入 30、40、50、60 mL的蒸餾水,在80℃水浴條件下提取2.0 h,按照1.3.1方法每組平行測定3次。

    2)考察提取時間對紅毛藻多糖提取量的影響

    精密稱取 1.0 g紅毛藻粉末12份,每個條件平行3份,分別加入40 mL(料液比1∶40)蒸餾水,于80℃水浴條件下提取,再分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時停止提取,離心取上清液,按照1.3.1方法每組平行測定3次。

    3)考察提取溫度對紅毛藻多糖提取量的影響

    精密稱取 1.0 g 紅毛藻粉末12份,每個條件平行3份,分別加入 40 mL(料液比1∶40)蒸餾水,并分別于70、80、90、100℃下提取1.5 h,離心取上清液,按照1.3.1方法每組平行測定3次。

    1.3.5 紅毛藻多糖提取工藝優(yōu)化

    在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以紅毛藻多糖提取量為考察指標,以提取溫度、提取時間、料液比為因子進行L9(34)正交實驗,以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝。

    表1 正交實驗因素水平表

    1.3.6 提取工藝驗證

    為驗證建立的最佳提取工藝,本實驗進行3次平行實驗。稱取1.0 g紅毛藻3份,按照建立的最佳提取工藝進行提取,并按照1.3.1方法平行測定3次。

    1.3.7 紅毛藻多糖的抗氧化活性實驗

    1)紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測定

    分別用5支7 mL離心管移取0.04 mg/mL DPPH-乙醇溶液1.5 mL,再依次加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為2 mg/mL),并用水補足至3.0 mL,靜置30 min后在517 nm處測定溶液吸光度,計算紅毛藻多糖對DPPH自由基的清除率[4-5]。

    清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

    (2)

    式(2)中,A0為未加紅毛藻多糖溶液DPPH溶液的吸光度;A1為加紅毛藻多糖溶液后DPPH溶液的吸光度;A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

    2)紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測定

    分別向5支離心管加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為5 mg/mL),用蒸餾水補足至1.0 mL,然后每支離心管分別加入0.3 mL 6 mmol/L FeSO4、1.5 mL 6 mmol/L水楊酸,搖勻,最后加入30% H2O2啟動反應(yīng),靜置10 min后在510 nm處測定吸光度,計算紅毛藻多糖對羥基自由基的清除率[6-7]。

    清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

    (3)

    式(3)中,A0為未加紅毛藻多糖溶液時羥基溶液的吸光度;A1為加紅毛藻多糖溶液后羥基溶液的吸光度;A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

    2 結(jié)果

    2.1 多糖標準曲線測定

    根據(jù)1.3.1方法得到回歸曲線方程,如圖1所示,Y=9.945 0X-0.010 1(Y為吸光值,X為葡萄糖濃度),相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

    2.2 紅毛藻多糖提取單因素實驗

    2.2.1 料液比對紅毛藻多糖提取量的影響

    在水浴溫度80℃、提取時間2.0 h的條件下,分別以料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)提取紅毛藻多糖,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)料液比從1∶30到1∶50,紅毛藻多糖的提取量呈上升趨勢,以1∶30到1∶40上升的趨勢較大,之后上升趨勢較慢,基本上趨于平衡狀態(tài)。這主要是因為隨著料液比的增加,溶解的多糖也增多,且在一定范圍內(nèi)增加提取液的體積可以增大溶劑與提取物的接觸面積,使水溶性的多糖能夠較多地溶出,于是產(chǎn)生了隨水量增加而多糖提取量升高的現(xiàn)象,但是當(dāng)料液比增加到可以溶解所有能被提取出的多糖時,繼續(xù)增加水量,所溶解的多糖也不會再增加,出現(xiàn)了繼續(xù)加水而多糖提取量趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象??紤]后續(xù)多糖提取液濃縮干燥等能耗因素,料液比以1∶40為最佳。

    2.2.2 提取時間對紅毛藻多糖提取量的影響

    在水浴溫度80℃、料液比1∶40的條件下,分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時停止提取紅毛藻多糖,結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,隨著提取時間的延長,多糖提取量在0.5 h到1.5 h逐漸增加,但在1.5 h 到2.0 h過程中,多糖的提取量基本不增加。這可能是因為在提取初期,多糖能夠被不斷提取出來,但是隨著時間延長,多糖提取量逐漸升高而不再有明顯的變化,所以盡管時間延長也無法再提高多糖提取量。同時,也有可能是加熱過久導(dǎo)致部分多糖降解被破壞,從而導(dǎo)致提取量稍微下降。因此,提取時間選擇1.5 h 為最佳。

    2.2.3 提取溫度對紅毛藻多糖提取量的影響

    在料液比1∶40、提取時間1.5 h的條件下,分別于70、80、90、100℃下提取紅毛藻多糖,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,隨著提取溫度的升高, 多糖含量逐漸增大, 在90℃后多糖含量略微減少。這是因為多糖的溶解度隨著溫度的升高而升高,使得在一定范圍內(nèi)多糖提取量隨溫度升高而升高,但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時,由于多糖的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致其發(fā)生分解,且溫度過高會消耗能量,多糖提取量呈下降趨勢??紤]到經(jīng)濟成本和防止多糖在高溫下遭受破壞,提取溫度不宜過高,選擇最佳提取溫度為90℃。

    2.3 紅毛藻多糖提取工藝優(yōu)化

    在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以紅毛藻多糖提取量為考察指標,以提取溫度、提取時間、料液比為因子進行L9(34)正交實驗,以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝,正交實驗結(jié)果見表2、表3。

    表2 L9(34)正交實驗結(jié)果

    表3 正交實驗方差分析表

    由表2正交實驗結(jié)果直觀分析可得,提取溫度和提取時間對紅毛藻多糖的提取量影響較顯著,而料液比對紅毛藻多糖的提取量影響最小。通過優(yōu)化的最佳提取工藝為A3B3C2,即以料液比為1∶40、在90℃下提取2.0 h為最佳提取工藝。通過表3正交實驗方差分析結(jié)果進一步表明,提取溫度與提取時間對紅毛藻多糖的提取量起主要作用。

    2.4 提取工藝驗證

    從表4提取工藝驗證實驗結(jié)果可知,3份樣品的紅毛藻多糖的平均提取量為77.57 mg/g,RSD為2.80%,表明所建立的紅毛藻多糖提取工藝穩(wěn)定可行。

    表4 驗證實驗

    2.5 紅毛藻多糖的抗氧化活性實驗

    2.5.1 紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測定

    由實驗結(jié)果(圖5)可知隨著樣品濃度的增加,樣品的清除率也在不斷增加,說明紅毛藻多糖清除DPPH自由基呈劑量依耐型關(guān)系。根據(jù)樣品的濃度與清除率曲線結(jié)果可得,紅毛藻多糖清除DPPH自由基的IC50值為0.36 mg/mL。

    2.5.2 紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測定

    由實驗結(jié)果(圖6)可知紅毛藻多糖對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而提高,表明紅毛藻多糖濃度與羥基自由基的清除率呈正相關(guān)。根據(jù)樣品的濃度與清除率曲線結(jié)果可得紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。

    3 討論

    海藻多糖是藻類植物中重要的組成成分之一,約占干重的20%~70%,它是一類混合物,是海藻細胞間和細胞內(nèi)所含的各種高分子碳水化合物的總稱[8]。研究表明,海藻多糖具有廣泛的生物學(xué)活性,包括抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖等[9-13],因而其有望被開發(fā)成為保健品或者藥品,為實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有益的參考[14]。

    本實驗通過單因素實驗并結(jié)合正交實驗設(shè)計優(yōu)化紅毛藻多糖的提取工藝,最后確定紅毛藻多糖最佳提取工藝為料液比1∶40、在溫度為90℃下提取2.0 h。抗氧化活性研究表明紅毛藻多糖能有效清除DPPH自由基,其 IC50值為0.36 mg/mL;紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。本研究可為紅毛藻多糖的高值化開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù),也為海藻多糖的應(yīng)用前景[15]提供了理論參考。

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