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    馬鈴薯瘡痂病菌分離鑒定與抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果研究

    2021-06-29 01:00:38張鉉哲任雪琦徐浩然陳蘇慧
    關(guān)鍵詞:瘡痂誘導(dǎo)劑抗病

    張鉉哲,陳 梅,趙 雪,任雪琦,徐浩然,陳蘇慧

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)

    鏈霉菌是土壤腐生菌,具有產(chǎn)生生物活性次級(jí)代謝物能力,特別是抗生素以及一些細(xì)胞外水解酶和其他化合物。僅有少數(shù)鏈霉菌具有植物致病性,引起馬鈴薯、蘿卜、胡蘿卜、甜菜和甘薯等多種作物根部病害[1-2]。

    馬鈴薯瘡痂?。≒otato common scab,PCS)是由多種植物致病性鏈霉菌引起的一種全球性重要病害。在馬鈴薯生產(chǎn)中除馬鈴薯晚疫病外,PCS降低塊莖品質(zhì),導(dǎo)致薯皮粗糙,影響種薯生產(chǎn)、鮮薯銷售和加工[2-3]。Streptomycesscabies、S.acidiscabies和S.turgiscabies被認(rèn)為是引起馬鈴薯瘡痂病最普遍病原菌[4]。塊莖細(xì)胞未木栓化幼嫩皮孔易受感染,所以致病鏈霉菌在馬鈴薯塊莖快速膨大期間易侵入[5]。PCS為土傳病害,由于土壤環(huán)境復(fù)雜性以及土壤顆粒機(jī)械保護(hù)作用,為該病害防治增加難度?,F(xiàn)階段防治瘡痂病最有效管理策略為種植健康無病抗病品種,并結(jié)合化學(xué)殺菌劑防治。然而,目前無有效防治瘡痂病化學(xué)殺菌劑。由此可見,馬鈴薯瘡痂病防治成為生產(chǎn)和育種過程中亟待解決問題。

    抗病誘導(dǎo)劑可誘發(fā)植物自身免疫系統(tǒng),最終使植物獲得抵御病害能力,保護(hù)植物免受病原物侵害,也減少化學(xué)農(nóng)藥使用[6]。目前有多種抗病誘導(dǎo)劑用于防治馬鈴薯瘡痂病,龔秀會(huì)等研究表明,使用誘抗劑BTH抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有較好防治效果,最佳防效達(dá)63.59%[7]。目前水楊酸(Salicylic acid,SA)在馬鈴薯瘡痂病防治上報(bào)道較多,湯曉莉等研究表明,施用外源SA增強(qiáng)植株對(duì)瘡痂病系統(tǒng)抗性,顯著降低種薯感病率[8]。王宏虬等在結(jié)暑期至成熟期定期用SA葉面噴施,結(jié)果表明,可有效提高植株對(duì)瘡痂病抗性[9]。草酸(Oxalic acid,OA)、β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MJ)分別在誘導(dǎo)植株對(duì)黃瓜霜霉病[10]、馬鈴薯晚疫病[11]和辣椒青枯病[12]等病害上應(yīng)用廣泛,但在馬鈴薯瘡痂病防治上未見報(bào)道。為選出對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有良好誘抗效果抗病誘導(dǎo)劑,本研究采用5種抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯植株葉面噴霧,誘導(dǎo)馬鈴薯對(duì)瘡痂病抗病性,并測定各抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量影響以及對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果,以期為馬鈴薯瘡痂病防治提供新防治依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    高氏1號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,NaCl 0.5 g,K2HPO40.5 g,KNO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,F(xiàn)e?SO4·7H2O 0.01 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2~7.4。用于菌株產(chǎn)孢培養(yǎng)物。

    ISP2培養(yǎng)基:酵母提取物4 g,麥芽糖提取物10 g,葡萄糖4 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2~7.4。用于菌株分離和常規(guī)培養(yǎng)。

    供試誘抗劑:草酸、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MJ)、3-氨基丁酸(BABA)、2,1,3-苯并噻二唑(BTH)(化學(xué)純),均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供,12%中生菌素可濕性粉劑由福建凱立生物制品有限公司提供。

    供試馬鈴薯品種:大西洋。

    1.2 病樣采集與菌株分離

    病原菌采集與分離:2020年馬鈴薯收獲期間,于黑龍江省哈爾濱市采集患瘡痂病薯塊。采用稀釋分離法分離病原菌。首先用清水沖洗病薯并晾干,無菌刀切取病健交界處置于75%酒精內(nèi)消毒,無菌水漂洗3次。漂洗完畢后,分別置于無菌研缽中加入少量蒸餾水研磨成勻漿,靜置0.5 h使病原菌充分釋放至溶液中。4層無菌紗布過濾,并對(duì)濾液稀釋為10-1、10-2、10-3,分別吸取稀釋液30μL涂布于ISP2培養(yǎng)基平板上。涂板之前將均質(zhì)樣品55℃熱處理3 min以抑制增長迅速細(xì)菌。7 d后,選擇白色粉狀單菌落,采用劃線法純化3次,將純化后菌株編號(hào),于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 菌株鑒定

    1.3.1 菌株致病性鑒定

    參照Loria等方法[13],鏈霉菌屬用馬鈴薯塊莖切片法評(píng)價(jià)瘡痂病感病品種大西洋致病性。塊莖用0.5%NaOCl消毒后切成塊莖盤(直徑1.5 cm,厚度3 mm),置于培養(yǎng)皿中潤濕無菌濾紙。在28℃條件下,將菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d。將產(chǎn)孢菌落打成7 mm菌餅,將菌餅含菌一側(cè)緊貼于塊莖盤上。每個(gè)處理3次重復(fù),接種未接菌瓊脂塊為空白對(duì)照。28℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d后,檢測所有塊莖切片,觀察并統(tǒng)計(jì)馬鈴薯切片是否變褐,若變褐則該菌即具有致病性。

    1.3.2 致病菌形態(tài)觀察和生物學(xué)特性測定

    菌株形態(tài)觀察:在ISP2培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)特征和色素顏色。用蓋玻片輕壓長滿孢子鏈霉菌菌落,并用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲及孢子鏈形態(tài),根據(jù)病原菌形態(tài)特征,鑒定病原菌。鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》[14]。

    生物學(xué)特性測定:菌株碳源、氮源、H2S、纖維素分解、黑色素產(chǎn)生等生物學(xué)特性測定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》[14]。

    1.3.3 致病菌分子鑒定

    基因組DNA提?。翰捎脛⒈x等方法中優(yōu)化SDS法提取DNA[15]。

    序列PCR擴(kuò)增及同源性分析:鏈霉菌16SrD?NA通用引物序列為:PrimerA:5'CATTCACGGAG AGTTTGATCC 3',PrimerB:5'AGAAAGGAGGTG ATCCAGCC 3'。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸90 s,運(yùn)行30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。對(duì)所得序列于NCBI作Blast比對(duì),利用MEGA 7.0軟件作多序列比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

    1.4 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果

    1.4.1 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)病原菌離體作用

    將菌株于高氏1號(hào)培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)7d,用少量無菌水洗下病菌孢子,分裝至離心管中5000r·min-1離心10 min,棄去上清液,加入無菌水將孢子濃度調(diào)節(jié)至108CFU·mL-1,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    用無菌水將草酸、BABA、BTH、SA和MJ分別配制成5、10、20、50和100μg·mL-15個(gè)濃度,以清水處理為空白對(duì)照。采用紙碟法,將配置好菌懸液取100μL均勻涂布于瓊脂平板上,將圓形濾紙片(d=0.6 cm)分別用上述濃度誘導(dǎo)劑浸濕,置于瓊脂平板中央,每個(gè)濃度重復(fù)3次,28℃條件下暗培養(yǎng)7 d,觀察是否形成抑菌圈。

    1.4.2 抗病誘導(dǎo)劑田間試驗(yàn)

    試驗(yàn)于2019年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)站開展,播種地前茬作物為馬鈴薯,且馬鈴薯瘡痂病發(fā)生嚴(yán)重。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),共設(shè)計(jì)7個(gè)處理,每小區(qū)面積為18 m(23 m×6 m),各處理3次重復(fù)。采用壟作方法種植,各小區(qū)常規(guī)除草、中耕和施肥。精選健康無病且均勻一致馬鈴薯種薯,0.5%NaClO浸泡3 min表面消毒后,無菌水清洗晾干,再用10 mg·L-1赤霉素溶液浸泡30 min,將塊莖置于室內(nèi)保溫催芽。出芽后然后將塊莖切成含2~3個(gè)芽眼薯塊,置于室內(nèi)通風(fēng)處2 d后播種。

    5種抗病誘導(dǎo)劑施用濃度為50μg·mL-1,以殺菌劑12%中生菌素400μg·mL-1為藥劑對(duì)照,以施用清水為空白對(duì)照。田間馬鈴薯出苗25 d后開始使用藥劑,將抗病誘導(dǎo)劑均勻噴施到馬鈴薯植株葉面上,噴施程度為葉片無液滴滴落為止。中生菌素模擬灌溉處理,每株200 mL,每隔7 d施用1次,共施用4次。最后1次施用藥劑間隔7 d后,各小區(qū)采用5點(diǎn)取樣法,每個(gè)采樣點(diǎn)選取4株馬鈴薯,每小區(qū)共采集20株。調(diào)查測定各處理馬鈴薯產(chǎn)量,包括大中薯質(zhì)量(大中薯≥50 g)、小薯質(zhì)量(<50 g),計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

    薯塊瘡痂病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):薯皮健康,無病斑;Ⅰ級(jí):薯皮基本健康,所占面積未超薯皮表面積1/4;Ⅱ級(jí):所占面積為薯皮表面積1/4~1/3;Ⅲ級(jí):所占面積占薯皮面積1/3~1/2;Ⅳ級(jí):嚴(yán)重感病,病斑面積超過薯皮表面積1/2。

    發(fā)病率(%)=每小區(qū)發(fā)病種薯粒數(shù)/每小區(qū)收獲種薯粒數(shù)×100;

    病情指數(shù)(%)=∑(各級(jí)病薯數(shù)×該病級(jí)代表值)(/調(diào)查總薯塊數(shù)×最高級(jí)值)×100;

    相對(duì)防治效果(%)=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100。

    1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用DPS7.05軟件,應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 馬鈴薯瘡痂病癥狀及病原菌分離鑒定

    2.1.1 馬鈴薯瘡痂病癥狀

    從馬鈴薯田采集患病薯塊癥狀表現(xiàn)為:馬鈴薯塊莖表皮形成瘡痂病斑,發(fā)病部位為木栓化褐色病斑,病斑產(chǎn)生裂痕,病斑形狀不規(guī)則,呈點(diǎn)狀或連片分布,使塊莖表面變得粗糙且凹凸不平,塊莖發(fā)病癥狀如圖1A所示。

    2.1.2 菌株致病性測定

    將測試菌株菌餅接種至小薯片上,7 d后觀察測試菌株在小薯片上生長情況,且小薯片表面均產(chǎn)生褐色壞死,對(duì)照未產(chǎn)生褐變現(xiàn)象。經(jīng)測定,14株鏈霉菌中共獲得致病菌株9株,致病菌占比為64.3%,各菌株接種小薯片發(fā)病率均為100%,菌株致病癥狀如圖1B、C所示。

    2.1.3 菌株分離和形態(tài)觀察

    觀察致病菌株形態(tài)得出,各致病菌株在ISP2培養(yǎng)基平板上宏觀和顯微形態(tài)相同,均為菌落灰色,表面粗糙,邊緣不規(guī)則,菌落上方形成褶狀隆起,孢子灰色,孢子鏈直鏈狀(見圖2)。

    圖1 馬鈴薯瘡痂病癥狀圖及鏈霉菌致病癥狀Fig.1 Symptom of potato common scab and pathogenicity of isolates of Streptomyces spp.

    圖2 鏈霉菌形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of Streptomyces

    2.1.4 馬鈴薯瘡痂病菌生物學(xué)特性測定

    挑選代表性菌株HRB-20-9測定生物學(xué)特性,結(jié)果表明,該菌株以組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸、羥脯氨酸為單一氮源,以甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇為單一碳源,對(duì)20μg·mL-1鏈霉素、0.1%苯酚、0.5μg·mL-1結(jié)晶紫敏感,對(duì)10 IU·mL-1青霉素不敏感,在特定培養(yǎng)基中產(chǎn)生黑色素和H2S,產(chǎn)生淀粉酶使淀粉水解,符合S.scabies生理生化特征(見表1)。

    2.1.5 致病菌株分子鑒定

    采用16SrDNA引物作PCR擴(kuò)增測序,在NCBI中作Blast比對(duì),選取與測試菌株相似性較高序列和鏈霉菌典型菌株,利用MEGA 7.0作序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,HRB-20-9與S.scabies同源性較高(見圖3)。結(jié)合生物學(xué)特性將該菌株鑒定為S.scabies。

    2.2 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)致病鏈霉菌離體作用

    通過紙碟法測定5、10、20、50、100μg·mL-1誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌HRB-20-9離體作用,結(jié)果表明,不同濃度抗病誘導(dǎo)劑對(duì)致病鏈霉菌均未出現(xiàn)抑菌圈(見圖4),說明抗病誘導(dǎo)劑對(duì)病原菌無直接殺滅作用。

    表1 馬鈴薯瘡痂病菌生物學(xué)特性Table 1 Characteristics of potato common scab strains

    圖3 HRB-20-9菌株16Sr DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16Sr DNA sequencephylogenetic tree of HRB-20-9 strain

    2.3 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量的影響

    田間對(duì)各抗病誘導(dǎo)劑和殺菌劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量影響結(jié)果測定結(jié)果表明(見表2),產(chǎn)量為38 220~39 975 kg·hm-2內(nèi)波動(dòng),各處理間無顯著差異,說明5種誘導(dǎo)劑均對(duì)鈴薯產(chǎn)量無影響。

    2.4 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果

    抗病誘導(dǎo)劑和殺菌劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果調(diào)查結(jié)果表明,各抗病誘導(dǎo)劑及中生菌素對(duì)馬鈴薯瘡痂病均有一定防治效果(見表3),可減少瘡痂病發(fā)病率,其中MJ處理發(fā)病率最低,為82.4%,與清水對(duì)照相比降低17.6%。與使用殺菌劑中生菌素相比,SA和MJ防治效果菌顯著高于中生菌素,其中MJ防治效果最佳,防效達(dá)43.6%。其次是SA,防效為38.1%,而草酸和BABA防效相對(duì)較差,顯著低于中生菌素,防效僅為23.7%和20.6%。

    圖4 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)HRB-20-9離體抑制作用Fig.4 Effects of different concentrations of disease resistant inducers on HRB-20-9 in vitro

    表2 噴施不同誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of different inducers on potato yield

    表3 噴施不同抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果Table3 Control effect of spraying different diseaseresistanceinducerson potato common scab

    3 討論與結(jié)論

    馬鈴薯瘡痂病是一種嚴(yán)重土傳病害,致病菌由多種鏈霉菌組成,且不同地區(qū)致病菌分布存在差異。目前甘肅報(bào)道的病原菌有瘡痂鏈霉菌(S.scabies)、灰色鏈霉菌(S.griseus)、鮑比氏鏈霉菌(S.bobili)和加利利鏈霉菌(S.galilaeus)[16-17],河北地區(qū)致病菌有瘡痂鏈霉菌(S.scabies)、歐洲瘡痂鏈霉菌(S.europaeiscabiei)和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S.diastatochromogenes)[18],黑龍江哈爾濱市目前報(bào)道病原菌種有酸性瘡痂鏈霉菌(S.acidiscabies)和腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies)[19]。但未見S.scabies菌株報(bào)道。本研究從哈爾濱市采集具有典型瘡痂病癥狀馬鈴薯病斑上分離得到14株鏈霉菌,通過小薯片法測定發(fā)現(xiàn)9株(64.3%)具有致病性。根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)特性測定將致病菌株鑒定為S.scabies,說明哈爾濱地區(qū)馬鈴薯瘡痂病致病菌有S.scabies。

    采用紙碟法分別檢測草酸、SA、BABA、BTH、MJ對(duì)致病鏈霉菌生長影響。離體條件下不同濃度抗病誘導(dǎo)劑對(duì)病原菌未形成抑菌圈,說明誘抗劑對(duì)馬鈴薯致病鏈霉菌無毒殺作用,對(duì)馬鈴薯瘡痂病產(chǎn)生防治效果是其誘導(dǎo)馬鈴薯植株產(chǎn)生抗病性結(jié)果。田間試驗(yàn)中,使用5種抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯植株葉面噴施,研究表明不同誘導(dǎo)劑處理對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量無顯著影響,瘡痂病菌僅侵染馬鈴薯表皮層,并未造成馬鈴薯產(chǎn)量下降,也有研究表明,在瘡痂病發(fā)病嚴(yán)重時(shí),引起馬鈴薯產(chǎn)量降低[20]。誘導(dǎo)劑使用均降低馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率,并取得一定防治效果,其中MJ防治效果最佳,發(fā)病率與清水對(duì)照相比降低17.6%,防效高于中生菌素對(duì)照藥劑,達(dá)43.6%。說明抗病誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)馬鈴薯植株對(duì)瘡痂病抗性,從而產(chǎn)生抵抗病原菌能力,降低發(fā)病率,提高馬鈴薯品質(zhì)。目前,OA、MJ和BABA在馬鈴薯瘡痂病防治研究中未見報(bào)道。已有報(bào)道用于防治馬鈴薯瘡痂病抗病誘導(dǎo)劑有SA和BTH。楊鑫等使用不同抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯液面噴霧,結(jié)果表明不同誘導(dǎo)劑均降低瘡痂病發(fā)病率,其中SA防治效果達(dá)到43.98%[21]。湯曉莉等研究表明使用外源SA防治馬鈴薯瘡痂病,使馬鈴薯植株矮化,增強(qiáng)植株抗性,有效降低種薯感病率[8]。施用不同濃度誘抗劑BTH處理馬鈴薯植株,降低馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率和病情指數(shù),濃度為1.00 mmol·L-1時(shí),對(duì)瘡痂病相對(duì)防效高達(dá)63.59%[7]。而本研究中BTH防效較低,因此推斷其可能是由于使用劑量較低導(dǎo)致,其他使用劑量有待進(jìn)一步測定。王宏虬等開展馬鈴薯瘡痂病最適誘導(dǎo)劑篩選試驗(yàn),最適抗病誘導(dǎo)劑為SA,其防效顯著高于BTH,這一趨勢與本研究結(jié)果一致[9]。

    抗病誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物自身對(duì)外來病原物產(chǎn)生免疫反應(yīng),這類物質(zhì)在較低濃度下即被植物識(shí)別,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,從而抵御外來病原物侵染[22]。使用抗病誘導(dǎo)劑防治植物病害具有使用方便、有效、安全,對(duì)環(huán)境無副作用等特點(diǎn)[23]。因此抗病誘導(dǎo)劑可作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑和誘抗劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),有利于農(nóng)作物生長發(fā)育,降低植物病害發(fā)生率,減少化學(xué)農(nóng)藥使用量,提升農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究所選用5種抗病誘導(dǎo)劑中,MJ噴施馬鈴薯葉片防治效果最佳,可作為馬鈴薯瘡痂病最適誘抗劑,但本研究僅使用一個(gè)濃度,MJ使用最佳濃度還有待進(jìn)一步研究。目前抗病誘導(dǎo)劑在馬鈴薯瘡痂病防治上的應(yīng)用較少,在后續(xù)研究中可將誘導(dǎo)劑與化學(xué)殺菌劑混合使用,并結(jié)合使用抗性品種,以期為馬鈴薯瘡痂病防治提供更有效防治措施。

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