UHPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定啤酒中4種嘌呤

林欽恒，李圣男，鄧遠(yuǎn)強(qiáng)，鄭家概

廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心（廣州 510070）

嘌呤是一類(lèi)由一個(gè)嘧啶環(huán)和一個(gè)咪唑環(huán)稠和而成的生物堿類(lèi)物質(zhì)，主要包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及其衍生物[1]，是生物體內(nèi)核酸的重要組成部分，在代謝調(diào)節(jié)、能量供應(yīng)、組成輔酶等方面起著重要作用[2]。嘌呤在體內(nèi)經(jīng)代謝變化后的產(chǎn)物為尿酸，嘌呤代謝異?；蚰蛩崤判故茏钑r(shí)會(huì)導(dǎo)致血液中尿酸含量過(guò)高，從而引發(fā)高尿酸血癥，并可發(fā)展為痛風(fēng)、高血壓、糖尿病等多種代謝慢性疾病[3-4]。

嘌呤廣泛存在于食品中，食物攝入是人體外源獲取嘌呤的主要途徑[5]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大量攝入高嘌呤食物可明顯影響人體血液尿酸水平，增加高尿酸血癥和痛風(fēng)等疾病的發(fā)病率[6]，限制高嘌呤食物的攝入，并改善飲食結(jié)構(gòu)是緩解相關(guān)疾病的重要方式。高嘌呤食物主要集中在消費(fèi)量較大的畜禽肉類(lèi)、魚(yú)蝦貝類(lèi)、大豆及蔬菜類(lèi)等制品[7]。隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，啤酒等飲料也成為飲食中重要組成部分，研究顯示市售啤酒中的嘌呤物質(zhì)含量較高，約40～136 mg/L[8]，相關(guān)研究也表明，長(zhǎng)期飲用啤酒是高尿酸血癥發(fā)作的重要誘因[9]，啤酒與痛風(fēng)之間存在著較高的依存關(guān)系[8]。因而充分了解啤酒中嘌呤含量的數(shù)據(jù)具有重要意義，能為啤酒愛(ài)好者和高尿酸血癥患者的科學(xué)膳食提供一定指導(dǎo)。

國(guó)內(nèi)外尚未建立啤酒中腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤含量的準(zhǔn)確統(tǒng)一的測(cè)定方法，而食品中的嘌呤含量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法[5]等，也有報(bào)道將嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的間接測(cè)定法[11-12]。其中，高效液相色譜法最常應(yīng)用于啤酒等酒類(lèi)中4種嘌呤的檢測(cè)[1,13-14]，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本較低的優(yōu)點(diǎn)，但由于4種嘌呤均屬于弱堿性物質(zhì)，在C18色譜柱上的保留度較差，而采用紫外檢測(cè)器僅依靠保留時(shí)間定性，因此該法往往具有分離度差、效率較低、假陽(yáng)性率高、準(zhǔn)確度低的問(wèn)題。

試驗(yàn)在相關(guān)研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定啤酒中4種嘌呤含量的方法，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，為膳食結(jié)構(gòu)中飲用啤酒飲料的合理安排提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 6460A超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；BSA224S電子分析天平（精度0.000 1 g，賽多利斯科學(xué)儀器公司）；KQ-2200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WBK-4B電熱恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）；甲酸（色譜純，純度＞98.0%，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；三氟乙酸（色譜純，純度＞98.0%，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水；其余試劑（均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠）；啤酒樣品（市售）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于25 mL容量瓶中，加入水超聲溶解（嘌呤不易溶解于水可加入NaOH或HCl助溶），分別配制成質(zhì)量濃度約500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃保存。分別取適量的4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水稀釋配制成質(zhì)量濃度約10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再進(jìn)一步稀釋成合適的梯度濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3 樣品前處理

將啤酒樣品超聲脫氣，過(guò)濾，取1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入0.2 mL三氟乙酸和0.2 mL甲酸，搖勻，置于沸水浴100 ℃下水解1 h，取出，冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加水定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，以備分析。若含量太高可依需要用水進(jìn)行稀釋。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0.0～5.5 min，0%～6% A；5.5～7.5 min，100% A；7.5～11.0 min，0% A）；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：帶鞘氣流的電噴霧離子源（AJS ESI）。掃描模式：正離子模式。檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。離子源參數(shù)：干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速6.0 L/min；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11.0 L/min；霧化氣壓力40 psi；毛細(xì)管電壓4 000 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解條件的選擇

尤玉如等[15]的研究顯示，使用三氟乙酸-甲酸（1∶1）混合液100 ℃水解1 h，啤酒中嘌呤的提取效果最好；陸春梅等[13]研究表明，三氟乙酸-甲酸-啤酒比例0.2∶0.2∶1時(shí)，測(cè)得的嘌呤總含量最高。因此，在上述研究基礎(chǔ)上，采用三氟乙酸-甲酸-啤酒比例0.2∶0.2∶1，在沸水浴中水解1 h，作為樣品前處理酸水解的條件。

將4種嘌呤質(zhì)量濃度約1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述條件進(jìn)行水解，重復(fù)6次，并通過(guò)與未水解的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液比對(duì)計(jì)算平均回收率，考察嘌呤在該水解條件下的損失率。結(jié)果顯示，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤平均回收率分別為95.1%，93.7%，92.5%和94.0%，說(shuō)明在該水解條件下，游離嘌呤被分解和破壞的程度較小，損失較少，效果良好。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

提高4種嘌呤組分在色譜柱上的分離度有利于數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)比較3種實(shí)驗(yàn)室常用的Agilent色譜柱Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）、Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）和SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），結(jié)果顯示采用Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）時(shí)，4種嘌呤的分離度相對(duì)最優(yōu)。在該色譜柱上，考察3種流動(dòng)相體系：甲醇-含0.1%甲酸和0.5 mmol/L酸銨水溶液、甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-水。結(jié)果顯示，采用含0.1%甲酸和0.5 mmol/L乙酸銨水溶液時(shí)，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的保留時(shí)間均為3.5 min，不能有效分離；采用0.5 mmol/L乙酸銨水溶液時(shí)，鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤保留時(shí)間接近，均為3.7 min；采用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，4種嘌呤組分的分離效果相對(duì)達(dá)到最佳（見(jiàn)圖1）。因此，選擇Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）為色譜柱，甲醇-水作為流動(dòng)相體系。

圖1 4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的TIC色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將4種嘌呤質(zhì)量濃度約1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行電離和一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰后，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子的質(zhì)量數(shù)，并將在MRM模式下繼續(xù)優(yōu)化子離子的碰撞能量等參數(shù)，使得其響應(yīng)達(dá)到最優(yōu)。最終得到4種嘌呤的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1，采集得到的MRM色譜圖見(jiàn)圖2。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)

圖2 4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

將1.2配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，分別以4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程，并按照各組分的信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限，以S/N=10對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算定量限。結(jié)果表明（見(jiàn)表2），4種嘌呤組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)和峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999，檢出限（LOD）為6.0～12 μg/L，定量限（LOQ）為20～40 μg/L，相比于目前常用的高效液相色譜法，檢測(cè)靈敏度得到了提高（文獻(xiàn)[1]檢出限為0.02～0.17 mg/L）。

表2 4種的嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

選擇合適的啤酒樣品進(jìn)行嘌呤含量的加標(biāo)回收試驗(yàn)。先按試驗(yàn)條件處理分析測(cè)得本底值（n=4），以相對(duì)于本底值約50%，100%和150%的3個(gè)濃度水平添加嘌呤含量，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，并通過(guò)校正樣品本底值的方式計(jì)算平均回收率，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）。結(jié)果如表3所示，加標(biāo)樣品的平均回收率為80.5%～98.2%，δRSD（n=6）為1.3%～4.2%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度符合一般檢測(cè)的要求。

表3 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法對(duì)購(gòu)自超市的10種啤酒飲料進(jìn)行4種嘌呤含量的測(cè)定，并通過(guò)加和計(jì)算總嘌呤含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。其中，10號(hào)樣品為菠蘿啤，其原料及工藝和啤酒不同，故嘌呤含量比較低。由表4可知，啤酒（1～9號(hào)）中鳥(niǎo)嘌呤的含量最高，占總嘌呤含量的51.9%～65.7%，總嘌呤含量為36.4～60.4 mg/L，說(shuō)明啤酒屬于高嘌呤食品，飲食中應(yīng)予以限制。

表4 啤酒中嘌呤含量 單位：mg/L

試驗(yàn)同時(shí)還測(cè)定上述10種啤酒飲料未經(jīng)水解時(shí)游離態(tài)嘌呤含量（前處理不加強(qiáng)酸水解，其余同1.3），檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，啤酒（1～9號(hào)）的總游離態(tài)嘌呤含量為8.14～13.5 mg/L，其中黃嘌呤含量最高，占總游離態(tài)嘌呤量的51.6%～83.1%。啤酒水解前后，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤含量均有不同程度的增加，說(shuō)明在啤酒中這3種嘌呤主要以結(jié)合態(tài)存在，而黃嘌呤的含量水解后卻略有減少，說(shuō)明啤酒中黃嘌呤幾乎沒(méi)有結(jié)合態(tài)，含量降低推測(cè)系高溫酸水解造成部分損失所致。

表5 啤酒中游離態(tài)嘌呤含量 單位：mg/L

3 結(jié)論

建立同時(shí)測(cè)定啤酒中腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤4種嘌呤含量的分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確性高、精密度良好，采用UPLCMS/MS分析技術(shù)，兼具分析時(shí)間短、效率高、選擇性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果可靠，實(shí)現(xiàn)對(duì)啤酒中4種嘌呤組分進(jìn)行高效準(zhǔn)確的分析，適合于實(shí)際樣品的檢測(cè)，也為研究測(cè)定啤酒中的嘌呤組分及其類(lèi)似物提供可靠的檢測(cè)手段和參考依據(jù)。