超高效液相色譜法測(cè)定奶粉中四種常用香料

林正鋒，龐道標(biāo)，王朝政，徐志偉，禤開(kāi)智

?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心（?？?570311）

香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚和乙基麥芽酚4種香料被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1-3]，大劑量使用香蘭素和麥芽酚等香料可能會(huì)對(duì)嬰幼兒造成較大危害，人工香料的安全性越來(lái)越受到關(guān)注[4-6]。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]明確指出半歲以?xún)?nèi)嬰幼兒配方食品禁止加入任何食用香料。因此，建立高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的嬰幼兒配方奶粉中四種香料的分析方法對(duì)嬰幼兒乳粉質(zhì)量安全監(jiān)管有重要的意義。

此4種化合物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[8-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[2,11-12]、光度法[1]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]、二維液相色譜法[16]、離子色譜法[17-18]、電化學(xué)法[19-21]等。其中液相色譜法是使用最廣泛且較為經(jīng)濟(jì)的分析方法，目前未見(jiàn)采用液相色譜法同時(shí)測(cè)定奶粉中此4種香料物質(zhì)同時(shí)分析的方法，在其他基質(zhì)中這4種物質(zhì)的分析多采用常規(guī)高效液相色譜（HPLC）[9,22]，相比HPLC，超高效液相色譜（UPLC）在檢測(cè)靈敏度和分析效率上均有很大的優(yōu)勢(shì)[23]。

試驗(yàn)采用水-醚體系對(duì)樣品進(jìn)行提取，建立超高效液相色譜（UPLC）同時(shí)測(cè)定嬰幼兒乳粉中香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚4種香料化合物的方法。該方法具有高效、可靠、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，希望能夠?yàn)橄嚓P(guān)部門(mén)建立相關(guān)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)提供參考，保障奶粉質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、甲酸、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；乙酸銨、磷酸（色譜純，美國(guó)Merck公司）；鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；香蘭素（純度≥98%）、乙基香蘭素（純度≥98%）、麥芽酚（純度≥99%）、乙基麥芽酚（純度≥99%）：美國(guó)Sigma公司。奶粉樣品選用4種一段奶粉和6種其他奶粉（其中4種奶粉標(biāo)記有添加香料），市售，留做加標(biāo)試驗(yàn)和實(shí)際樣品測(cè)試。

1.2 儀器與設(shè)備

BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；H-Class型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MS3型渦旋儀（德國(guó)IKA公司）；320 R型低溫離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；Advantage A10型超純水凈化儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

樣品前處理方法：稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL 50 ℃的水，以3 000 r/min渦旋混勻2 min，冷卻至40 ℃后，超聲提取15 min，超聲頻率為37 kHz，再加入20.0 mL叔丁基甲醚，以3 000 r/min渦旋混勻3 min，再加入10 g無(wú)水硫酸鈉除水，以3 000 r/min渦旋混勻2 min，以9 000 r/min離心3 min，吸取3.0 mL上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入2.85 mL 1%氫氧化鈉溶液反萃，以3 000 r/min渦旋混勻1 min后，以3 000 r/min離心3 min，用移液器準(zhǔn)確移取0.95 mL下層清液至刻度試管中，加磷酸定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.5%甲酸水。梯度洗脫程序：0～1.0 min，10% A～25% A，1.0～4.0 min，25% A，4.0～4.1 min，25% A～90% A，4.1～5.0 min，90% A，5.0～6.0 min，90% A～10% A。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Empower色譜工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析采集分析色譜圖，保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。試驗(yàn)結(jié)果采用平均值表示，每個(gè)試驗(yàn)平行3次，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取體系的選擇

直接用有機(jī)溶劑提取奶粉樣品時(shí)，其對(duì)樣品浸潤(rùn)效果較差，難以保證提取效果。文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道奶粉中4種香料化合物檢測(cè)采用的提取體系多為水-甲醇體系和水-乙腈體系，由于甲醇、乙腈和水為互溶體系，難以采用液液萃取進(jìn)一步凈化和濃縮，還需采用成本較高且耗時(shí)的固相萃取富集凈化[13-15]。為此，試驗(yàn)分別考察了一系列水不互溶的有機(jī)溶劑對(duì)奶粉樣品的提取效果，包括水-二氯甲烷、水-三氯甲烷、水-叔丁基甲醚、水-乙酸乙酯提取體系，其目的是能夠較容易地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的富集和濃縮。由圖1可以看出，使用二氯甲烷、三氯甲烷作為提取劑時(shí)，奶粉容易結(jié)塊，提取效率難以保證，而且離心之后提取溶劑在下層，移取不方便；用乙酸乙酯提取，當(dāng)加入無(wú)水硫酸鈉之后，提取體系變黏稠，固化嚴(yán)重，渦旋分散效果較差，無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效提??；用叔丁基甲醚提取，渦旋時(shí)溶液均勻分散，離心后有機(jī)相澄清，液相色譜分析結(jié)果表明其對(duì)四種化合物提取效果均較好。因此，最終選擇水-叔丁基甲醚為提取體系。

圖1 奶粉樣品在不同提取體系中的提取效果

2.2 四種化合物在水醚兩相的分配情況

受酚類(lèi)化合物檢測(cè)中常用酸堿分配凈化方法啟發(fā)[24]，即酚類(lèi)化合物在酸性條件下微溶于水，較易溶于有機(jī)溶劑；而堿性條件下形成鹽易溶于水，難溶于有機(jī)相。試驗(yàn)用鹽酸和氫氧化鈉配制系列pH（pH 1～14）的溶液，各取10 mL與等體積的含1 μg/mL麥芽酚、香蘭素、乙基麥芽酚、乙基香蘭素的叔丁基甲醚充分混合，分別測(cè)定兩相中四種化合物的含量，各化合物不同pH條件下在水相中的含量見(jiàn)圖2。在堿性條件下，隨著堿性的提高，四種化合物在水相中的比例增大，在pH＞13的情況下，四種化合物基本都集中在水相中，這可能是四種化合物均呈弱酸性[15]，在高堿性條件下能形成離子狀態(tài)，使其在水中溶解性大大提高。籍芳等[25]采用混合型強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱凈化富集香蘭素和乙基香蘭素也是利用其具有酚羥基的特性。在酸性和中性條件下，四種化合物在兩相中的分配比例基本保持不變，pH 3時(shí)，麥芽酚、乙基麥芽酚和香蘭素在水中的含量約為50%，24%和17%，說(shuō)明在中性和酸性條件下，叔丁基甲醚無(wú)法完全提取這三種目標(biāo)物。這是由于三種化合物極性較強(qiáng)，極性越強(qiáng)，其在水中的分配越強(qiáng)，液相色譜分析中幾種化合物的出峰順序（圖3）也表明四種化合物的極性由強(qiáng)到弱依次為麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素、乙基香蘭素，楊華梅等[15]發(fā)現(xiàn)麥芽酚和乙基麥芽酚的極性較大，導(dǎo)致兩者在普通的C18固相萃取小柱不保留。因此，試驗(yàn)最終選擇在水-叔丁基甲醚體系提取，同時(shí)加入無(wú)水硫酸鈉，使水全部轉(zhuǎn)化為結(jié)晶水，從而將麥芽酚、香蘭素、乙基麥芽酚、乙基香蘭素全部轉(zhuǎn)移至有機(jī)相。離心后取上清液，用pH＞13的堿液反萃除去雜質(zhì)，用磷酸調(diào)節(jié)pH后進(jìn)入液相色譜分析。由圖3可以看出，采用堿液反萃后樣品雜峰很少，說(shuō)明該法凈化具有很好的凈化效果。

圖2 四種化合物在水相中的含量與pH關(guān)系圖

2.3 色譜條件選擇

試驗(yàn)比較了水-乙腈和水-甲醇流動(dòng)相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，四種化合物分離效果明顯優(yōu)于水-甲醇流動(dòng)相體系。楊華梅等[15]采用液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定四種化合物水-甲醇流動(dòng)相體系也存在香蘭素和乙基麥芽酚保留時(shí)間重疊嚴(yán)重的現(xiàn)象，質(zhì)譜可通過(guò)提取特征離子對(duì)進(jìn)行定性定量。確定水-乙腈為流動(dòng)相后，考察了乙腈-0.1%乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.5%甲酸、乙腈-1%甲酸、乙腈-0.5%磷酸對(duì)四種化合物出峰的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.1%乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸進(jìn)行分離，色譜峰均存在一定程度的拖尾現(xiàn)象，而使用乙腈-0.5%甲酸、乙腈-1%甲酸、乙腈-0.5%磷酸進(jìn)行分離，色譜峰無(wú)明顯拖尾，但考慮到強(qiáng)酸環(huán)境會(huì)降低色譜柱的使用壽命，最終選擇乙腈-0.5%甲酸作為流動(dòng)相。在此色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品譜圖如圖3（A和D）所示，4 min內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)4種化合物完全出峰且實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，從而實(shí)現(xiàn)快速分離。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和奶粉樣品色譜圖

2.4 線(xiàn)性范圍和定量限

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度范圍0.05～50 μg/mL），在所確定的試驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)作圖，采用強(qiáng)制過(guò)原點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，4種化合物線(xiàn)性關(guān)系良好。根據(jù)10倍信噪比，并計(jì)入試樣量和定容體積，計(jì)算定量限。四種化合物的線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)及定量限見(jiàn)表1。

表1 四種化合物的回歸參數(shù)和定量限

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在上述確定的色譜條件和前處理?xiàng)l件下，進(jìn)行5個(gè)不同濃度水平的添加回收試驗(yàn)，其回收率與精密度見(jiàn)表2。4種化合物在5種不同添加水平下，其回收率均比較穩(wěn)定，在80.1%～98.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說(shuō)明該方法檢測(cè)穩(wěn)定性較好。

表2 空白樣品加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用該方法對(duì)市售10件奶粉樣品進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明，3件奶粉樣品檢出乙基香蘭素，含量分別為10.2（成人奶粉），15.6（孕婦配方奶粉）和45.2 mg/kg（較大嬰兒奶粉）；1件奶粉檢出香蘭素，含量為3.60 mg/kg（較大嬰兒奶粉），此4件奶粉標(biāo)簽中均標(biāo)注添加相應(yīng)的香料，檢出值均符合GB 2760—2014的規(guī)定。其余嬰幼兒配方奶粉中均未檢出4種香料。

3 結(jié)論

綜上所述，試驗(yàn)建立了超高效液相色譜同時(shí)測(cè)定奶粉中香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚四種香料含量的方法。前處理采用水-叔丁基甲醚提取，氫氧化鈉溶液萃取凈化，有效去除干擾物質(zhì)。結(jié)果表明，該方法具有操作簡(jiǎn)便、分析效率高、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣，有望為相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。